四种禽类Sox8基因部分cDNA序列的克隆及其PCR-SSCP分析

摘要

该研究根据GenBank上发表的鸡Sox8基因序列设计引物,采用RT-PCR法克隆测序了鸭、鹧鸪、孔雀和榛鸡的部分cDNA序列,并比较了五种禽类克隆片段的核苷酸和氨基酸的同源性,总体上禽类Sox8基因的同源性较高,核苷酸的同源性在96﹪以上,氨基酸的同源性在97﹪以上,说明Sox8基因在禽类中高度保守.在Sox8基因的编码区设计七对引物,通过PCR-SSCP标记技术对六个地方鸡种的Sox8基因的编码区进行了单核苷酸多态性分析,并对有多态的DNA片段进行了克隆测序,结果在外显子3发现两个突变位点:即786C→T和1350G→A,但两处突变均是沉默突变.经统计分析和计算各种基因型频率及基因频率表明:等位基因A在肉鸡中的频率比在蛋鸡中的频率高.因此,该实验得出趋势性结论:等位基因A的基因频率可能同脂肪性状呈正相关.另一个突变位点的基因频率在肉鸡和蛋鸡中没有发现升高或降低的趋势.

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1 Sox8基因的研究动态与趋势

1.1.1 Sox基因家族的研究现状

1.1.2 Sox8基因生物学功能的研究

1.2克隆技术概述

1.2.1定位克隆

1.2.2电子克隆

1.3分子标记在动物育种中的应用

1.3.1 RFLP标记

1.3.2 SSR标记

1.3.3 ISSR标记

1.3.4 DNA指纹标记

1.3.5 RAPD随机扩增多态性

1.3.6 AFLP标记

1.3.7 PCR-SSCP标记

1.4研究的目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2器材与试剂

2.2.1主要仪器设备

2.2.2主要药品及试剂

2.2.3缓冲剂及主要试剂的配制

2.3实验方法

2.3.1样本采集

2.3.2 RNA的提取

2.3.3鸡血样DNA的提取

2.3.4基因组DNA的纯化

2.3.5核酸浓度和质量的检测

2.3.6引物的合成与设计

2.3.7 RT-PCR反应

2.3.8 PCR反应(SSCP分析)

2.3.9 PCR产物的纯化

2.3.10连接反应

2.3.11感受态细胞的制备

2.3.12转化

2.3.13重组质粒的鉴定

2.3.14质粒的提取

2.3.15双酶切鉴定

2.3.16 SSCP分析

2.3.17统计方法

3结果与分析

3.1四种禽类Sox8基因部分cDNA的克隆与序列分析

3.1.1 RNA的浓度与质量检测

3.1.2 RT-PCR扩增四种禽类Sox8基因部分cDNA的结果

3.1.3四种禽类Sox8基因部分cDNA的克隆

3.1.4四种禽类Sox8基因部分cDNA的测序和同源性分析

3.2六个地方鸡种Sox8基因编码区的单核苷酸多态性分析

3.2.1 PCR扩增结果

3.2.2基因类型检测结果

3.2.3纯合型基因片段的克隆与测序

3.2.4序列分析结果

3.2.5不同品种三种基因型的比较分析

3.2.6六个地方鸡种Sox8基因频率同脂肪性状的相关性研究

4讨论

4.1 RNA的提取

4.1.1 RNA酶活性的抑制

4.1.2注意事项

4.2关于RT-PCR反应的若干问题

4.3 Sox8基因的序列分析

4.4 Sox8基因单核苷酸多态性与群体遗传学的初步研究

4.5 PCR-SSCP技术的影响因素

5结论

6参考文献

7致谢