山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建

摘要

当前畜牧业生产中所使用的卵泡刺激素(FSH)产品都是从牛、羊、猪等家畜的脑垂体中直接提取的,由于材料来源有限、纯度差且常有其它激素的污染、影响了FSH的广泛应用.用基因工程方法可大量生产高纯度的FSH,降低生产费用,这对畜牧业生产具有重要意义.该试验是从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板,PCR扩增目的基因片段,分别获得长为360bp的山羊FSH-α亚基DNA片段和长为390bp的山羊FSH-β亚基DNA片段,与预期的目的的基因片段大小一致.将它们分别克隆至pMD18-T,随机挑选几个阳性重阳子进行测度.将测序结果与绵羊等多种哺乳动物该基因及相应的氨基酸进行同源性比较、分析.该研究首次进行了山羊FSH的基因克隆、序列分析及表达载体构建方面的探索,填补了国内外重组山羊FSH基础研究的空白,为今后重组山羊FSH的大量生产应用提供了理论基础和实验依据.

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1 FSH的概况

1.1.1 FSH的性质与作用

1.1.2 FSH基因的分子结构

1.2 FSH的应用

1.2.1 FSH的应用基础

1.2.2 FSH在动物繁殖育种中的应用

1.2.3 FSH在人类相关疾病治疗上的应用

1.3重组FSH的国内外研究概况

1.3.1 FSH基因的克隆研究

1.3.2重组FSH的表达研究

1.3.3重组FSH的体内外活性研究

1.4本实验研究的目的和意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1实验用组织

2.1.2菌株

2.1.3质粒载体

2.1.4工具酶及DNA分子量标准

2.1.5试剂盒

2.1.6引物

2.1.7培养基

2.1.8主要化学试剂

2.1.9主要仪器设备

2.2试验方法

2.2.1样品采集

2.2.2总RNA的提取

2.2.3 RT-PCR扩增山羊FSH-α、β亚基基因

2.2.4RT-PCR扩增产物的鉴定与同源性比较、分析

2.2.5山羊FSH单亚基真核表达载体的构建

2.2.6FSH双亚基真核表达载体的构建

3实验结果

3.1山羊总RNA的提取

3.2山羊FSH-α亚基基因的克隆、序列测定与同源性比较、分析

3.2.1山羊FSH-α亚基基因的克隆

3.2.2山羊FSH-α亚基基因的序列测定

3.2.3山羊与其它哺乳动物FSH-α亚基基因和氨基酸同源性比较、分析

3.3山羊FSH-β亚基基因的克隆、序列测定与同源性比较、分析

3.3.1山羊FSH-β亚基基因的克隆

3.3.2山羊FSH-β亚基基因的序列测定

3.3.3山羊与其它哺乳动物FSH-β亚基基因及氨基酸同源性比较

3.4山羊FSH单亚基真核表达载体的构建

3.4.1真核表达重组子gFSH-α-PF的双酶切和PCR鉴定

3.4.2真核表达重组子gFSH-β-PF的双酶切和PCR鉴定

3.5 FSH双亚基真核表达载体的构建

3.5.1真核表达重组子gFSH-α-β-PF的双酶切和PCR鉴定

3.5.2真核表达重组子dFSH-α-gFSH-β-PF的双酶切和PCR鉴定

4讨论

4.1总RNA的提取

4.2关于RT-PCR反应

4.2.1关于逆转录反应

4.2.2关于PCR反应

4.3山羊FSH基因及其氨基酸的同源性比较、分析

4.4载体构建

5结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢