兔产气荚膜梭菌（A型）α毒素原核表达产物免疫原性分析

摘要

兔产气荚膜梭菌病(Clostridium perfringens disease)是由A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的兔的一种消化道传染病,各年龄、各品种兔均可发病,以幼兔和青年兔发病率最高,死亡率可达100﹪,严重危害养兔业的发展.对于该病主要致病因子α毒素的研究具有重要意义.该实验从A型产气荚膜梭菌(NJ株)的总DNA中,通过PCR扩增出α毒素全基因,构建克隆载体pMD18TC α.测序结果显示A型产气荚膜梭菌(NJ株)的α毒素基因全长1194bp,含有完整的开放阅读框,编码398个氨基酸,其中前28aa为信号肽,后370aa构成成熟的α毒素.将核苷酸序列与GeneBank中已发表的菌株NCIB19681(typeB)、NCIB10662(typeC)和L9(typeD)的α毒素基因序列进行比对,同源性达到99.27﹪.将α毒素全基因从克隆载体pMD18TC α亚克隆到表达载体pPRO-EX HTb中,构建表达载体pPROHTbCα,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了诱导表达研究.将α毒素基因部分序列从克隆载体pMD18TCα分别亚克隆到表达载体pPRO-EX HTa和pET-30b中,获得重组表达载体pPROHTaPα和pET30bPα,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出特异的大小分别为36KD和38KD的融合蛋白.光密度扫描分析重组菌BL21(DE3)pET30bPα表达的蛋白含量达到30﹪,经金属亲和层析获得高纯度的His-tagged融合蛋白.采用Western-blot分析表明,重组菌BL21(DE3)pPROHTaPα和BL21(DE3)pET30bPα表达出的特异性产物和纯化产物均具有和α毒素抗血清反应的抗原特异性.把以包涵体形式存在的表达的重组蛋白α toxinA和α toxinB,以尿素变性,经复性、浓缩后获得了可溶性的蛋白质,并对可溶性蛋白α toxinB凝胶过滤层析的纯化方法进行了摸索.免疫琼脂扩散实验的结果表明表达的重组蛋白α toxinA和α toxinB可以和α毒素抗血清发生免疫沉淀反应;免疫家兔获得抗α toxinB的抗血清和抗α toxinA的抗血清都可以和A型产气荚膜梭菌强毒株产生的α毒素发生免疫沉淀反应.该研究为兔产气荚膜梭菌病的流行病学调查、诊断试剂的开发以及基因工程疫苗的研制提供了理论依据和物质基础.

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1兔产气荚膜梭菌病病源学研究进展

1.1.1产气荚膜梭菌培养特性和生化特性

1.1.2产气荚膜梭菌毒力因子的分类及其引起的相关疾病

1.1.3产气荚膜梭菌α毒素研究进展

1.2兔产气荚膜梭菌病临床发病特征

1.2.1发病原因

1.2.2流行特点

1.2.3临床症状和病理变化

1.3兔产气荚膜梭菌病的实验室诊断和防治措施

1.3.1常规诊断

1.3.2染色荧光诊断

1.3.3分子生物学诊断

1.3.4防治措施

1.4本课题的研究目的和意义

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌株

2.1.2质粒与感受态细胞

2.1.3实验试剂和材料

2.1.4产气荚膜梭菌培养基的配制

2.1.5实验动物

2.1.6主要实验仪器

2.2实验方法

2.2.1产气荚膜梭菌α毒素全基因的克隆和测序

2.2.2产气荚膜梭菌α毒素全基因的表达

2.2.3产气荚膜梭菌α毒素的提取

2.2.4产气荚膜梭菌α毒素部分序列基因表达载体的构建和表达Ⅰ

2.2.5产气荚膜梭菌α毒素部分序列基因表达载体的构建和表达Ⅱ

2.2.6重组蛋白的大量提取

2.2.7复性后蛋白凝胶过滤层析

2.2.8蛋白αtoxinB和αtoxinA的免疫学检测

3实验结果

3.1产气荚膜梭菌α毒素全基因的克隆和测序结果

3.1.1产气荚膜梭菌α毒素全基因的PCR扩增

3.1.2重组质粒pMD18TCα鉴定

3.1.3 α毒素全基因序列测定及同源性比较

3.2产气荚膜梭菌α毒素全基因的表达结果

3.2.1重组表达载体pPROHTbCα的鉴定

3.2.2重组表达载体pPROHTbCα在大肠杆菌中的表达

3.3重组表达载体pPROHTaP α的鉴定和表达结果

3.3.1重组表达载体pPROHTaPα的鉴定

3.3.2重组表达载体pPROHTaPα在大肠杆菌中的表达

3.4重组表达载体pET30bPα的表达及产物纯化结果

3.4.1重组表达载体pET30bPα的鉴定

3.4.2重组表达载体pET30bPα在大肠杆菌中的表达

3.4.3表达产物的纯化和峰值测定

3.4.4表达产物Western-blot分析

3.5 α毒素部分序列基因序列测定及同源性比较结果

3.6复性后蛋白αtoxinB的凝胶过滤纯化结果

3.7免疫琼脂扩散反应结果

4讨论

4.产气荚膜梭菌的培养和α毒素的提取

4.2α毒素的克隆

4.3α毒素的表达

4.4包涵体的变性及复性蛋白的纯化

4.5复性蛋白αtoxinB和αtoxinA的免疫原性

5结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢