IBV国内分离株的分离鉴定及其mRNA3和mRNA4 5′端独特区分子特征

摘要

鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒科(Coronaviridae)鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病.病鸡的特征性临床症状为咳嗽、喷嚏、气管啰音,蛋鸡产蛋量及蛋品质下降.IB在世界范围内分布,虽然已广泛应用疫苗,但其发生仍然十分普遍,给养殖业造成严重的经济损失.IBV基因组全长27.6kb,是不分节段的单股正链RNA病毒,结构蛋白主要由S(纤突蛋白)、N(核蛋白)、M(膜蛋白)和E(小膜蛋白)组成.冠状病毒IBV的变异最易发生在S蛋白上,S蛋白是决定IBV毒力和血清型的病毒结构因素.近年的研究表明M基因和N基因也不同程度的发生变异.E蛋白与M蛋白在协同参与病毒复制和病毒出芽中发挥重要作用,对E蛋白和M蛋白基因遗传变异和功能性研究正逐渐引起世界各国学者们的研究兴趣.该实验以国内空间跨度较大的两株IBV地方分离株HLJ1和SC为研究对象,参照已发表的mRNA3和mRNA4 5′端独特区编码序列,设计一对引物用于扩增3a、3b、3c(E)和M基因.经序列分析发现:3a、3b、3c和M基因在SC和HLJ1分离株之间长度相同,没有基因缺失和插入.它们的3a、3b、3c和M基因分别由174bp、189bp、327bp和678bp组成,相应的编码产物为57、62、108和225氨基酸残基.SC和HLJ1 3a、3b和3c核苷酸序列的同源性分别为96.0﹪、91.5﹪和96.0﹪,推导氨基酸序列同源性为91.2﹪、88.7﹪和95.4﹪.SC与国内外不同IBV参考株3a、3b、3c核苷酸及推导氨基酸序列最大差异率分别为19﹪(26.3﹪)、27.5﹪(41.9﹪)、19.9﹪(21.6﹪).HLJ1与不同IBV参考株的3a、3b和3c的核苷酸同源性分别为79.9﹪~99.4﹪、77.8﹪~98.9﹪和80.7﹪~96.0﹪,推导氨基酸同源性为71.9﹪~98.2﹪、64.5﹪~98.4﹪和75.5﹪~95.4﹪.HLJ1和SC分离株M基因核苷酸序列同源性及推导氨基酸序列同源性分别为95.9﹪和98.2﹪.HLJ1和SC与IBV参考株M蛋白的核苷酸序列最大差异率分别为16.8﹪和16.4﹪.3a、3b、3c及M进化树分析结果表明,HLJ1和SC株在同一进化群内,并且和国内大多数分离株进化关系密切,与国外分离株在不同的进化分支上.对SC和HLJ1 E和M蛋白二级结构的预测结果表明:HLJ1 E蛋白N端为15个连续的氨基酸无规卷曲空间构象,SC在此区域的空间构象为α-螺旋和无规卷曲交替变化.HLJ1 M基因在21-23位、136-146位氨基酸空间构象以无规卷曲为主要特征,SC株在这些区域则以α-螺旋为主要构象;HLJ1株在25-30氨基酸位点的氨基酸空间构象以Strand为主型,SC株则表现为Strand-Helix-Strand二级空间构象的交替变化.113、148位的氨基酸改变,使相应的二级结构构象发生改变,由Coil→Strand.M蛋白是膜相关蛋白,20-100位氨基酸至少跨膜三次,碳端在囊膜内侧,与核衣壳相连,仅一小部分(约10﹪)糖基化的N端暴露在囊膜外.HLJ1分离株在78位氨基酸处的抗原性较SC分离株强,推测77-83氨基酸形成抗原表位.

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1鸡传染性支气管炎研究进展

1.2鸡传染性支气管炎分子流行病学

1.3 鸡传染性支气管炎mRNA3、mRNA4 5′端独特区研究概况

1.4研究目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.2.1IBV的分离鉴定

2.2.2 IBV分离株的增殖与RNA提取

2.2.3 RT-PCR扩增目的基因

2.2.4IBV分离株的基因克隆

2.2.5重组质粒的鉴定

2.2.6基因片段的序列测定

2.2.7序列的比较分析

3结果

3.1 IBV分离株的鉴定

3.1.1鸡胚病变检查

3.1.2血凝效价的测定

3.1.3电镜观察结果

3.1.4 SPF鸡攻毒试验

3.2 IBV分离株3a、3b、3c和M基因的克隆鉴定与序列分析

3.2.1 IBV分离株3a、3b、3c和M基因的克隆与鉴定

3.2.2 IBV分离株3a、3b、3c和M基因的序列测定

3.2.3 IBV分离株3a、3b和3c基因同源性分析

3.2.4IBV3a、3b和3c（E）基因序列进化树分析

3.2.5 IBV分离株E蛋白二级结构预测

3.2.6IBVE蛋白亲水性分析

3.2.7IBV分离株M基因序列比较分析

3.2.8IBV M基因序列进化树分析

3.2.9IBV M蛋白疏水性分析

3.2.10IBV M蛋白抗原位点及膜表面特性

3.2.11 IBV M基因二级结构预测

4讨论

4.1 IBV国内分离株的分离鉴定

4.2 IBV mRNA3 5′端独特区分子特征

4.3 IBV M基因的分子特征

5结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文

致谢

附录