鹅细小病毒结构蛋白基因遗传进化分析及其基因免疫研究

摘要

鹅细小病毒(gooseparvovirusGPV)是细小病毒科(Parvoviridate)、细小病毒属(ParvovirusGenus)的成员。主要感染1月龄内雏鹅和雏番鸭以急性肠炎及肝、肾、心实质脏器炎症为特征的烈性传染病。该病危害程度与日龄密切相关，10日龄内雏鹅发病率和死亡率可达100％，在易感群中的致死率高达70％，以后发病随日龄增大而逐渐减少。但近几年有报道称该病的发病日龄有增大趋势，超过30日龄的占14.3％，这可能与鹅细小病毒毒力增强和基因变异有关。自1956年我国学者方定一首次发现并分离到病毒至今，国内外一直有分离到该病毒的报道，说明该病已经呈世界范围流行，对养鹅业发展威胁很大。 该病毒可造成大鹅呈—过性隐性感染，不表现发病症状，但可带毒、排毒造成病毒的水平或垂直传播。目前本病的预防主要是采用疫苗进行免疫接种。小鹅除采用疫苗接种外，还要结合小鹅瘟高免血清进行紧急预防。因此寻找该病毒的毒力基因及抗原性基因遗传演化规律，筛选合适的疫苗进行有效防控；同时研制安全无毒有效的基因工程疫苗替代活苗免疫，将是逐步控制、消除本病的大趋势。 本研究首先分离鉴定了黑龙江省鹅细小病毒发病地区的一株病毒，命名为GPVHG\21，该毒株的ELD50值显示其为一强毒株。以GPVHG\21株和两致弱疫苗株GPVHg1株、GPVHg2株为研究对象，分别克隆、测序三个病毒株的结构蛋白基因片段，共得到九个克隆片段，即GPVHG\21VP1、GPVHG\21VP2、GPVHG\21VP3片段；GPVHg1VP1、GPVHg1VP2、GPVHg1VP3片段和GPVHg2VP1、GPVHg2VP2、GPVHg2VP3片段。之后采用DNAStar分子生物学分析软件，对上述三个毒株的共九个克隆片段进行比较分析。通过系统演化分析，揭示了GPV的遗传演化与地域因素的相关性规律；通过对GPVHG\21株结构蛋白三个完整基因片段的抗原性预测图谱比较，发现在三段基因片段的非重叠区，也存在抗原性位点的信息；通过比较还发现GPVHg2疫苗株与GPVHG\21分离株抗原性图谱更为接近，即采用以GPVHg2疫苗株去防治以GPVHG\21毒株引发的鹅细小病毒病将更为合理有效。另外通过对强毒株GPVHG\21和弱毒株GPVHg1、GPVHg2结构蛋白基因VP1序列的比较研究，发现了与GPV毒力强弱有关的基因位点，即VP1基因的第1611位和第2127位的核苷酸差异与毒株毒力强弱有关。此外以pcDNA5/TO为载体，以GPVHG\21株的三个结构蛋白基因片段为研究对象，分别构建了三个结构蛋白基因片段的真核表达载体，近而搭建了进行结构蛋白基因免疫研究的平台，通过对三个真核表达质粒体外转染鹅胚成纤维细胞的体外表达检测和免疫小鼠、大鹅等动物的体内表达检测结果，说明三个真核基因表达质粒都可以在体外细胞中成功表达，并能诱发动物体内的体液免疫和细胞免疫两种形式的机体免疫反应。进一步为鹅细小病毒核酸疫苗的研究提供了理论依据。

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文摘

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1引言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

致谢

参考文献

附录

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