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声明
1前言
1.1 Myostatin基因概况
1.1.1 Myostatin基因的发现
1.1.2 Myostatin基因的结构
1.1.3 Myostatin基因的保守性
1.1.4 Myostatin基因表达研究
1.1.5 Myostatin基因的生物学功能
1.1.6 Myostatin基因的应用前景
1.2基因打靶技术
1.2.1基因打靶技术的概念
1.2.2基因打靶载体类型
1.2.3实现基因敲除的途径
1.2.4基因敲除技术的应用
1.3转基因动物
1.3.1外源基因导入受体细胞方法
1.3.2转染细胞的筛选方法
1.3.3体细胞核移植的研究
1.3.4转基因猪的研究概况及其应用前景
1.4本研究的目的和意义
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1主要器材
2.1.2主要药品及配制
2.1.3 DNA分析软件与网址
2.1.4实验动物
2.2实验方法
2.2.1大白猪成纤维细胞体外培养体系的建立
2.2.2 Myostatin转染质粒的准备
2.2.3打靶载体转染大白猪胎儿成纤维细胞
2.2.4阳性细胞核移植的体外发育
3结果与分析
3.1细胞培养的结果
3.1.1胰酶消化法大白猪胎儿成纤维细胞的培养
3.1.2组织块法大白猪胎儿成纤维细胞的培养
3.1.3细胞的冻存和复苏
3.1.4大白猪胎儿成纤维细胞的生长曲线
3.1.5大白猪胎儿成纤维细胞的核型分析
3.2转染质粒扩繁结果
3.2.1无内毒素质粒的提取
3.2.2质粒的酶切鉴定结果
3.2.3线性化载体的纯化
3.3转染的结果
3.3.1 G418筛选浓度的选择结果
3.3.2转染条件的优化
3.3.3细胞筛选结果
3.3.4阳性细胞核型分析结果
3.3.5阳性细胞DNA提取结果
3.3.6阳性细胞PCR检测结果
3.3.7转染前细胞内RNA提取结果
3.3.8阳性细胞RNA提取结果
3.3.9转染前后细胞中Myostatin基因表达量的差异
3.3.10重构胚在体外发育情况
4讨论
4.1细胞供体的年龄的选择
4.2细胞培养体系的建立
4.3细胞的分离纯化
4.4转染方法
4.5打靶载体的选择
4.6 G418筛选浓度的选择
4.7关于GANC筛选
4.8关于筛选后阳性细胞的培养
4.9关于阳性细胞核型
4.10关于阳性细胞的鉴定
4.11转染前后Myostatin基因表达的检测
4.12核移植
5结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文