马耳他布鲁氏菌M5-90 bp26基因缺失疫苗株的构建及安全性和免疫原性评估

摘要

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的人畜共患病，在世界范围内导致巨大的经济损失，布鲁氏菌（Brucella）是该病病原，主要经过消化道、皮肤粘膜和呼吸道等途径侵入机体而发生感染和发病。布鲁氏菌主要寄生于网状淋巴组织，造成免疫系统病理进程，并常伴随有菌血症，对生殖、神经和骨骼系统造成严重损害。
　　 牛、羊等家畜是该病的主要传染源，接种疫苗是预防布鲁氏菌病的重要措施，但现有疫苗免疫后抗体持续存在，经典血清学诊断方法均不能有效区分疫苗免疫和自然感染，这对该病防治与净化是不利的，要从根本上清除该病必须研制新型疫苗，既能起到预防和切断布鲁氏菌的传播，又能将免疫与自然感染区分，标记疫苗是解决该问题一个很有前途的手段。
　　 马耳他布鲁氏菌疫苗株M5-90是在M5的基础上继续致弱获得，与M5相比对怀孕母羊更安全，其安全性和有效性等项指标均达世界先进水平。M5-90已被广泛应用于牛羊布鲁氏菌的疫苗防制，取得巨大成功，为我国人、畜布鲁氏菌病的有效控制作出重要贡献。
　　 Bp26蛋白为布鲁氏菌周质蛋白，具有较好的免疫活性，通常被用来作为血清学检测的靶蛋白，bp26基因的缺失突变不改变疫苗株的生物学特性和免疫保护原性。采用重组表达BP26蛋白为抗原建立的i-ELISA方法敏感性和特异性与布鲁氏菌s-LPS提取物为抗原的常规间接ELISA相近，bp26被认为是目前布鲁氏菌最为合适标记疫苗的靶基因之一。
　　 本研究以bp26基因作为重组靶位点，以疫苗株M5-90为亲本，通过同源重组将卡那霉素抗性基因（Kanar）整合到M5-90布鲁氏菌基因组中，完全取代bp26基因的ORF，筛选双交叉重组阳性菌株。通过SDS-PAGE和Western blot检测，亲本菌株M5-90中迁移率约为29kd的BP26蛋白表达并可被鼠抗重组BP26蛋白的高免血清识别，而缺失株中该位置的反应结果为阴性；同时，bp26基因缺失菌株免疫小鼠制备的血清不能识别重组BP26蛋白，而亲本株M5-90免疫小鼠制备的血清与重组BP26蛋白反应为阳性。以上结果表明BP26蛋白在bp26基因缺失菌株中未表达，缺失株命名为M5.90-26。
　　 生物学特性鉴定证明，缺失株M5-90-26保持了光滑型特性，在形态学、生化特性、凝集特性和染料抑菌特性方面与亲本株M5-90保持了一致。从生长曲线看，生长和复制能力与亲本株M5-90差异不显著。
　　 小鼠康复时间试验结果表明，缺失株M5-90-26的残留毒力与亲本株M5-90相比，统计学分析二者差异不显著，康复时间约为13周，但在不同的时间段内毒力稍低。菌落分离曲线显示，二者在小鼠体内都以随时间递减的趋势从体内被清除，统计学显示二者差异不显著。而布鲁氏菌马耳他种的强毒株M28虽然也随时间递减，但15周内始终高出以上两种菌株约3.5Log10，差异显著，这也证明了M28强毒菌株特性和作为攻毒菌株的可行性。小鼠攻毒保护试验证明，M5-90和M5-90-26免疫45d和150d后，均引发机体产生了坚强的保护力，无论脾脏分离布鲁氏菌数还是脾脏重量，免疫组与PBS对照组差异都显著。免疫45d后，马耳他种强毒M28和流产种强毒544攻击结果表明，M5-90和M5-90-26免疫组比PBS对照组的菌落分离数低约2.48～2.97Log10/脾脏，脾脏重量与PBS对照组相差2.86～3.48倍，差异均显著。而M5-90-26与M5-90相比较，在以上两个方面差异均不显著，证明M5-90-26与M5-90在短期内诱导产生免疫保护力一致。免疫150d后M28攻毒保护试验表明，M5-90-26和M5-90同样产生了高水平的免疫保护力。M5-90-26和M5-90免疫组脾脏分离布鲁氏菌数与PBS对照组低约2.6～4.6Log10，同时脾脏重量免疫组与PBS对照组相差2倍，差异均显著，而免疫组之间差异不显著，证明M5-90-26同样保持了与M5-90一致的长期免疫保护能力。免疫持续期与短期免疫效力相比，缺失株M5-90-26保持了与亲本株M5-90相同的保护效力，二者均能维持在较高水平。
　　 小鼠体内s-LPS特异性抗体监测实验表明，缺失株M5-90-26可诱导与亲本株M5-90相似的体液免疫应答。以s-LPS为抗原的i-ELISA检测M5-90和M5-90-26免疫小鼠血清显示，特异抗体在免疫后第1周出现，第12周到达高峰，随后开始下降。统计分析表明二者差异不显著。免疫45d后攻毒，M5-90和M5-90-26产生了s-LPS抗体的记忆应答，抗体OD值呈明显上升趋势，并且二者之间差异不显著。实验表明缺失株M5-90-26与亲本株M5-90一样可以引发高水平的抗s-LPS体液免疫应答。
　　 以rBP26为抗原的i-ELSIA检测M5-90、M5-90-26和M28接种小鼠血清结果显示，M5-90和M28接种小鼠后体内BP26抗体在免疫后第1周出现，随后上升，到第4周时P/N比值均大于5，M28接种的BP26抗体一直维持在较高水平，而缺失株M5-90-26始终没有检测到BP26特异的抗体。免疫45d后攻毒，M5-90免疫组BP26抗体出现明显升高，而缺失株M5-90-26没有变化，表明没有抗BP26蛋白抗体被诱导出来。在小鼠体内证明可以利用i-ELISA将缺失株M5-90-26免疫血清与强毒M28感染小鼠血清区分开，为建立与标记疫苗配套的检测方法奠定理论与实践基础，证明了缺失株作为疫苗候选株应用的可行性。
　　 羊水平传播试验证明，免疫M5-90和M5-90-26的羊未感染同群混养的空白羊。免疫后1、3个月时通过RBT和s-LPS i-ELISA检测未发现空白羊的血清布鲁氏菌抗体转阳，证明二者没有水平传播能力。体外排菌检测试验表明，免疫M5-90和M5-90-26后未能在眼、鼻、口和生殖道等天然孔分离到疫苗菌株，证明肘关节内侧皮下免疫方式不会在以上天然孔排菌。体内组织布鲁氏菌分离试验表明，M5-90和M5-90-26在羊体内停留时间约为2个月，免疫后2.5个月和3个月后不能在淋巴结、肝、脾和肾分离到这两种疫苗菌株。毒力返强试验证明在羊体内3代盲传后毒力与传代前差异不显著，证明该缺失株毒力较稳定。以上结果表明，缺失株M5-90-26保持了与亲本株M5-90相似的安全性和复制水平。
　　 羊体内免疫原性试验证明，M5-90-26能够引发与M5-90同样水平的体液免疫应答。RBT检测证明M5-90-26与M5-90免疫后1周后98％～100％羊血清转阳，70～80d后开始下降，6个月之后下降到20％～30％，二者差异不显著。s-LPS i-ELISA证明二者诱导的抗体水平一致，细胞免疫检测表明M5-90-26与M5-90没有差异。证明M5-90-26与M5-90在羊体内的免疫原性保持了高度一致。
　　 综上所述，M5.90-26与亲本疫苗株M5-90相比，无论是安全性还是免疫原性都没有发生改变。其作为疫苗有着良好的应用前景，缺失株M5-90-26具备从血清学角度区分M5-90-26免疫与野生型布鲁氏菌感染的能力，对布鲁氏菌病防制、监测及净化具有重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 前言

1.1 布鲁氏菌的简介

1.1.1 布鲁氏菌的历史

1.1.2 布鲁氏菌种和生物型的分类

1.1.3 布鲁氏菌病原学特征

1.2 布鲁氏菌病

1.2.1 布鲁氏菌病的危害

1.2.2 流行病学

1.3 布鲁氏菌病的诊断

1.3.1 病原学鉴定

1.3.2 血清学检测方法

1.3.3 变态反应（过敏反应）试验

1.4 疫苗

1.4.1 传统疫苗

1.4.2 基因工程疫苗

1.5 布鲁氏菌病在中国的流行

1.5.1 中国布鲁氏菌病流行概况

1.5.2 中国布鲁氏菌病流行优势菌株

1.5.3 中国布鲁氏菌病诊断主要难点

1.6 BP26蛋白的特性

1.7 本研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细菌与质粒

2.1.2 引物

2.1.3 试剂

2.1.4 试验动物

2.1.5 试验仪器

2.1.6 抗血清

2.2 实验方法

2.2.1 同源重组质粒pSP-bp26-k的构建

2.2.2 缺失株M5-90-26的构建与PCR鉴定

2.2.3 缺失株M5-90-26生物学特性鉴定

2.2.4 缺失株M5-90-26的生长曲线测定

2.2.5 缺失株M5-90-26 Western blot鉴定

2.2.6 缺失株M5-90-26在小鼠体内免疫保护评估

2.2.7 缺失株M5-90-26在羊体内的安全性及免疫原性评估

2.2.8 统计分析

3 结果与分析

3.1 同源重组载体pSP-bp26-k的构建及鉴定

3.1.1 同源臂基因与卡那霉素抗性基因扩增及序列测定

3.1.2 同源重组质粒pSP-bp26-k鉴定

3.2 缺失株M5-90-26鉴定

3.2.1 缺失株M5-90-26的PCR鉴定

3.2.2 缺失株M5-90-26 Western blot鉴定

3.3 缺失株M5-90-26生物学特性研究

3.3.1 缺失株M5-90-26生化特性鉴定

3.3.2 缺失株M5-90-26的形态学

3.3.3 缺失株M5-90-26的生长曲线

3.4 缺失株M5-90-26在小鼠体内免疫保护评估

3.4.1 小鼠康复时间的测定

3.4.2 小鼠短期免疫保护试验

3.4.3 小鼠免疫持续期试验

3.4.4 BP26抗体的监测

3.4.5 s-LPS抗体的监测

3.5 缺失株M5-90.26在羊体内的免疫原性试验

3.5.1 缺失株M5-90-26免疫后的抗体水平监测

3.5.2 缺失株M5-90-26免疫后淋巴细胞增殖试验

3.6 缺失株 M5-90-26在羊体内的安全性评估

3.6.1 缺失株M5-90-26体外排菌检测

3.6.2 缺失株M5-90-26水平传播试验

3.6.3 缺失株M5-90-26体内残留毒力试验

3.6.4 缺失株M5-90-26毒力返强实验

4 讨论

4.1 缺失株M5-90-26作为疫苗的理论与实践依据

4.2 缺失株M5-90-26的构建策略

4.3 缺失株M5-90-26筛选与鉴定

4.4 缺失株M5-90-26生物学特性的鉴定

4.5 缺失株M5-90-26在小鼠体内BP26抗体的检测

4.6 缺失株M5-90-26在小鼠体内免疫保护评估

4.7 缺失株M5-90-26在羊体内的免疫原性及安全性评估

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文