白菜小孢子培养再生植株染色体倍性分子检测技术研究

摘要

白菜是我国栽培蔬菜中分布最广，栽培面积最大的蔬菜类作物之一。目前，在白菜的育种工作中主要利用游离小孢子培养技术，这种方法能够在1-2年得到纯合的双单倍体植株，但是其培养的再生植株主要是单倍体和二倍体植株的混合群体。长期以来人们主要通过花蕾期观察植株的花器形态来鉴别植株的倍性。这种方法不仅费时，并且不能处理大量植株。研究表明，甲基化是基因组DNA的一种主要的表观遗传修饰方式，在植物中以胞嘧啶甲基化为主。甲基化修饰在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用，可以影响植物的花期、育性、花及叶片的形态等。本研究利用了MS-RE PCR法，SRAP标记和MSAP标记，同时结合形态学鉴定法和根尖染色体制片法对白菜小孢子培养的再生植株进行倍性鉴定。获得以下研究结果：
　　 1. 对小白菜品种（BFS060964）进行游离小孢子培养，最终得到9株再生植株，其中2株单倍体，7株二倍体，自然加倍率77.7％。构建单倍体和二倍体混合池后，利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法，结合SRAP分子标记技术，对混合池进行筛选，共筛选768对引物组合，得到2对含有多态性的引物组合，利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法检测结果与根尖染色体制片法鉴定结果一直，表明小白菜小孢子培养获得的再生植株中倍性与基因组DNA甲基化有关，可以利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法检测小白菜品种（BFS060964）游离小孢子培养再生植株的倍性。
　　 2. 对小白菜，大白菜，菜心，菜薹等不同品种的白菜类作物进行游离小孢子培养，将单倍体和二倍体再生植株，分别混合构建单倍体和二倍体混合池后，利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法，结合SRAP分子标记技术，对混合池进行筛选，共筛选1928对引物组合，没有得到含有多态性的引物组合，表明利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法，结合SRAP分子标记技术的方法不能用于不同品种白菜类作物构建的单倍体和二倍体混合池。
　　 3. 对小孢子培养获得再生植株的自然加倍率较高的大白菜品种(Z16)进行游离小孢子培养，最终得到17株再生植株，其中3株单倍体，14株二倍体，自然加倍率82.4％。构建单倍体和二倍体混合池后，利用MSAP标记对混合池进行筛选，共筛选64对引物组合，得到2对含有多态性的引物组合，表明此种方法可以用于分析甲基化与白菜小孢子培养获得的再生植株倍性的关系。