抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其对应抗原表位区分析

摘要

小鹅瘟（Gosling plague，GP）是由细小病毒科、依赖病毒属中的鹅细小病毒（Goose Parvovirus，GPV）引起的一种烈性传染病。主要侵害4日龄至20日龄内的雏鹅和雏番鸭，可以引起急性肠炎及肝、肾、心等实质脏器败血性病变，尤其以小肠部位的纤维性、栓塞性病变为主要特征，发病率和死亡率可高达90％以上。目前，此病每年都有不同程度的流行，是养鹅及番鸭地区最主要的传染病之一，造成了严重的经济损失。由于本病长期困扰着养鹅业的发展，所以需要一种能够准确、简便的诊断方法来对该病作出早期诊断。鹅细小病毒NS1蛋白（GPV-NS1）是鹅细小病毒的主要非结构蛋白，通过单克隆抗体技术对GPV-NS1抗原表位进行研究，不仅有助于了解其抗原结构的功能，而且为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法提供了必要的物质材料支持，以期对该病做出早期的诊断。
　　 本研究首先构建了真核表达载体pcDNA3.1-GPV-NS1，同时构建了带有表达载体pET30a(+)的重组GPV-NS1，并在大肠杆菌原核表达系统中进行了表达，利用GPV感染鹅的血清（GPV活疫苗毒免疫10周的鹅血清）对表达产物进行Western blot分析，证实表达的融合蛋白具有较好的免疫原性。然后以重组质粒pcDNA3.1-GPV-NS1及纯化重组蛋白GPV-NS1为抗原，分组免疫4-6周龄Balb/c鼠，免疫三次后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，并初步研究其部分生物学特性。结果共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚型鉴定结果显示，2株为IgG2a型，4株为IgM型，轻链均为κ链。通过间接免疫荧光显示，4株单抗均与鹅胚成纤维细胞表达的pcDNA3.1-GPV-NS1发生强荧光信号，进一步证明了单抗的特异性。
　　 Western blot结果表明，所制备的单抗与重组NS1蛋白发生特异性反应。用本实验室制备保存的15个相互重叠且覆盖整个GPV-NS1截短表达的重组蛋白，对抗GPV-NS1的单克隆抗体进行Western blot的鉴定，初步证实了单克隆抗体1B2、3F12和4C6的表位存在于GPV-NS1的498～532aa内；3D9的表位存在于485～532aa内；2D4的表位存在于485～514aa内；3H8的表位存在于543～573aa内。鉴定出3个抗原表位区，分别位于NS1 485～514aa，498~532aa和543～573aa。
　　 本研究制备了抗GPV-NS1单抗，并对其相应抗原表位区域进行研究，有助于了解其抗原结构的功能，也为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法提供了物质基础。