土壤放线菌的分离、鉴定及其活性化合物的研究

摘要

放线菌由于其产生抗生素、酶及其抑制剂等有用生物活性物质，具有巨大经济价值，至今发现的两万种生物活性物质中，约70％是由放线菌产生的。而土壤又是放线菌含量最丰富的地方，因此开发土壤放线菌具有十分重要的意义。为了从土壤中分离出放线菌；以及从这些菌株的发酵物中分离出新的微生物农药。本研究采用了选择性培养基结合三重抗生素抗性筛选法对土壤放线菌进行筛选，对筛选的菌株进行了其活性化合物的研究，具体研究内容如下：
　　 （1）放线菌的分离。对来自四川省达州市、湖北省武汉市、山东省临沂市、辽宁省海城市、黑龙江省哈尔滨市等五个地区的土样进行自然干燥等预处理后，采用选择性分离培养基腐殖酸培养基加20μg/mL的萘啶酮酸进行放线菌的选择性分离。共分离得到54株放线菌。
　　 （2）高活性菌株的筛选。采用链霉素（Streptomycin）、庆大霉素（Gentamicin）及利福平（Rifampicin）三重抗生素抗性筛选法对所得到的放线菌进行进一步筛选。最终得到4株活性很高的放线菌，其分别是10号、49号、50号和52号放线菌，并对其进行了进一步研究。
　　 （3）发酵粗提物对细菌和真菌的抑制研究。将4株放线菌的发酵粗提物，进行了对2种细菌及9种致病真菌的抑菌活性研究，结果表明，其发酵粗提物对细菌的抑菌圈均达到20mm以上，对9种真菌也表现出了不同程度的抑制活性，有的甚至达到了95％以上。
　　 （4）发酵粗提物的除草活性研究。将这4株放线菌的发酵粗提物进行了2种除草剂靶标酶的筛选和除草活性的测定。结果显示10号菌株的发酵粗提物能抑制天冬酰胺合成酶，同时对稗草和苘麻均有很强的抑制作用。
　　 （5）发酵粗提物的温度稳定性研究。经过对这4株放线菌的发酵粗提物的热稳定性研究，得出的结果是10号、50号和52号放线菌的发酵粗提物对温度的稳定性较好，当温度达到90℃时，还具有很强的抑菌活性；49号菌株的发酵粗提物对温度的稳定性较弱，当温度达到30℃，其抑菌活性就完全丧失了。
　　 （6）放线菌的分类学研究。结合经典分类和分子生物学中16SrDNA分类，对这4株放线菌的分类研究表明：其形态特征、培养特征、生理生化特征均与链霉菌属一致：其其中10号放线菌同链霉菌Streptomyceslavendulae的相似性达到99％；49号放线菌同链霉菌Streptomycesviolaceolatus的相似性达到99％；50号放线菌同链霉菌Streptomycesolivaceus的相似性达到99％；52号放线菌同链霉菌Streptomycespactumstrain173848的相似性达到100％。进一步确定这4株放线菌均属于链霉菌属（Streptomyces）。
　　 （7）发酵粗提物的分离。将这4株放线菌的发酵粗提物进行了分离、纯化及结构鉴定。结果显示，其中从10号菌株中分离出了6种化合物；49号菌株中分离出了化合物fogacin，50号菌株中分离出了具有抗癌、抑菌、除草等多种用途的活性化合物borrelidin，从52号菌株中分离出了2种化合物。
　　 （8）化合物的活性验证。进行了化合物borrelidin的除草及抑菌活性测定，结果表明化合物borrelidin具有很强的除草活性及抑菌活性。

目录

文摘

英文文摘

英文目录

1 引言

1.1 微生物农药的研究进展

1.1.1 微生物农药

1.1.2 微生物杀菌剂

1.1.3 微生物杀虫剂

1.1.4 微生物除草剂

1.1.5 微生物植物生长调节剂

1.2 抗生素抗性筛选方法的研究进展

1.3 放线菌分类鉴定的研究进展

1.3.1 放线菌的经典分类

1.3.2 放线菌的化学分类

1.3.3 放线菌的分子生物学分类

1.3.4 放线菌的多相分类

1.4 课题来源、研究内容及意义

1.4.1 课题来源

1.4.2 研究内容及意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 土壤样品

2.1.2 试剂及仪器

2.1.3 生物活性测定菌

2.1.4 杂草

2.1.5 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 土样中放线菌的分离

2.2.2 放线菌的三重抗生素抗性筛选

2.2.3 放线菌的种子培养及液体发酵培养

2.2.4 发酵液的活性测定

2.2.5 发酵粗提物的稳定性试验

2.2.6 放线菌的分类鉴定

2.2.7 活性物质的分离、纯化及结构鉴定

2.2.8 对分离出的化合物的活性验证

3 结果与分析

3.1 土壤中放线菌的分离结果

3.2 放线菌的三重抗生素抗性筛选结果

3.3 发酵粗提物的活性测定结果

3.3.1 发酵粗提物的抑菌活性测定结果

3.3.2 发酵粗提物的除草活性测定结果

3.3.3 发酵粗提物对天冬酰胺合成酶的抑制

3.3.4 发酵粗提物对乙酰羟酸合成酶的抑制

3.4 发酵粗提物的稳定性研究

3.5 4株活性较高的菌株的分类鉴定

3.5.1 4株放线菌的形态特征

3.5.2 4株放线菌的培养特征

3.5.3 4株放线菌的生理生化特征

3.5.4 4株放线菌的16SrDNA鉴定

3.6 活性物质的分离、纯化及结构鉴定

3.7 化合物的活性验证

4 讨论

4.1 放线菌选择性分离

4.2 放线菌的抗生素抗性筛选

4.3 放线菌的活性研究

4.4 活性物质稳定性的研究

4.5 放线菌的分类鉴定

5 结论

致 谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文