外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性

摘要

动物转基因技术主要应用于动物品种改良、生产珍贵蛋白、建立疾病模型、基因治疗和器官移植等方面。近十年来，转基因技术与体细胞核移植技术的结合使转基因的生产有了突飞猛进的发展。目前人们已获得小鼠、大鼠、猪、牛和羊等多种转基因克隆动物，本实验室也于2006年获得了我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪。但是，成功获得转基因动物并不是转基因动物研究的最终目的，如何利用转基因技术为人类的需求服务才是科研人员始终要面对的课题。在畜牧生产领域，通过转基因技术培育家畜新品种是转基因技术应用的重要体现，在我国这方面已经引起了广泛关注。但迄今为止，外源基因在转基因动物中无法稳定的遗传和表达仍然是转基因遗传育种产业化亟待解决的问题。据此，本研究以绿色荧光蛋白基因猪及其后代为研究对象，以GFP外源基因为研究目标，通过对外源基因整合位点、拷贝数以及启动子区DNA甲基化和组蛋白H3、H4及特定赖氨酸位点乙酰化修饰的检测，阐明表观遗传修饰、位置效应和遗传对外源基因表达的调控机制。
　　 主要研究结果如下：
　　 1.0.25uM组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理24h和0.5uM DNA甲基化酶抑制5-AZA-dC处理48h对猪胎儿成纤维细胞的活率没有明显影响；
　　 2.TSA和5-AZA-dC处理转基因猪成纤维细胞可以通过阻止外源基因启动子区DNA甲基化和组蛋白去乙酰化提高外源基因表达水平和阳性细胞率，并且每10天采用TSA和5-AZA-dC联合处理转基因猪成纤维细胞能使外源基因在至少在60天内维持高水平的表达；
　　 3.在转基因猪不同组织之间，外源基因的表达水平存在显著差异（P<0.05），并且除了卵巢外，在不同转基因猪同种组织之间外源基因的表达水平也存在显著差异（P<0.001）；
　　 4.外源基因启动子区DNA甲基化、组蛋白H3和H3K9及H4乙酰化修饰在相同转基因猪不同组织之间和不同转基因猪同种组织之间都存在显著差异（P<0.001）；
　　 5.TSA和5-AZA-dC联合处理后，外源基因启动子区DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰在不同转基因猪成纤维细胞系间不存在显著差异（P>0.05），但外源基因表达水平之间的差异仍然显著（P<0.001）；
　　 6.外源基因表达在转基因猪成纤维细胞体外扩增和转基因猪生长发育以及繁殖传代过程中都显著下降（P<0.001）；
　　 7.外源基因启动子区DNA甲基化修饰在转基因猪成纤维细胞体外扩增和转基因猪生长发育以及繁殖传代过程中逐渐上升；
　　 8.外源基因拷贝在转基因猪成纤维细胞体外扩增和转基因猪生长发育以及繁殖传代过程中都显著下降（P<0.001）；
　　 9.外源基因拷贝数在转基因猪各种不同组织中不存在显著差异（P=0.059）；
　　 10.外源基因表达水平与拷贝数呈正相关（βc>0），与启动子区DNA甲基化水平呈负相关（βM<0）；

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1.前言

1.1 转基因动物研究概况

1.1.1 转基因动物的生产方法

1.1.2 转基因动物的检测

1.1.3 转基因动物的发展前景及存在的问题

1.2 表观遗传修饰对外源基因表达的影响

1.3 外源基因的位置效应

1.4 外源基因的遗传

1.5 本研究的目的意义

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 工具酶及试剂盒

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 主要生物学分析软件

2.2 实验方法

2.2.1 猪成纤维细胞的分离培养

2.2.2 猪成纤维细胞药物处理及活率分析

2.2.3 流式细胞分析术

2.2.4 基因组DNA及总cDNA的获得

2.2.5 Southern blot

2.2.6 Western blot

2.2.7 Q-PCR

2.2.8 亚硫酸氢盐测序

2.2.9 染色体免疫共沉淀

2.2.10 外源基因拷贝数的检测

2.2.11 外源基因整合位点的检测

2.2.12 数据统计分析

3.结果

3.1 TSA和5-AZA-dC对外源基因表达和表观遗传修饰的影响

3.1.1 TSA和5-AZA-dC处理猪成纤维细胞方法的筛选

3.1.2 TSA和5-AZA-dC处理对外源基因在转基因猪成纤维细胞中表达的影响

3.1.3 TSA和5-AZA-dC处理对外源基因启动子区表观遗传修饰的影响

3.1.4 TSA和5-AZA-dC处理对外源基因表达和表观遗传修饰的维持

3.2 位置效应对外源基因表达和表观遗传修饰的影响

3.2.1 位置效应对外源基因表达的影响

3.2.2 位置效应对外源基因启动子区DNA甲基化修饰的影响

3.2.3 位置效应外源基因启动子区组蛋白乙酰化修饰的影响

3.2.4 位置效应对外源基因表达的直接调控作用

3.3 外源基因在组织器官分化、体外和体内遗传过程中表达、拷贝数和启动子区甲基化修饰的变化

3.3.1 外源基因在组织器官分化、体外和体内遗传过程中表达的变化

3.3.2 外源基因在组织器官分化、体外和体内遗传过程中拷贝数的变化

3.3.3 外源基因在组织器官分化、体外和体内遗传过程中启动子区甲基化修饰的变化

3.3.4 外源基因拷贝数和启动子区甲基化修饰对外源基因表达的影响

4.讨论

4.1 关于外源基因的表观遗传修饰

4.2 关于外源基因的位置效应

4.3 关于外源基因的遗传

5.结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文