外源基因VEGF在转基因绒山羊中的表达和遗传稳定性研究

摘要

血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)，是一种可以在动物毛囊中表达的毛乳头细胞自分泌生长因子。研究表明，VEGF基因可以在体内诱导血管新生，对于动物毛囊发育和毛发生长起重要作用。因此本实验室选择VEGF基因作为外源基因对阿尔巴斯白绒山羊进行转基因培育，期望获得高产绒量的转基因绒山羊，并为进一步探索VEGF基因在动物体内的作用机理提供实验依据。
　　本实验室近年来通过体细胞克隆技术获得的VEGF转基因绒山羊中，有羊绒产量显著提高和羊绒产量未出现明显改善的转基因绒山羊，并且成年转基因绒山羊通过有计划的配种产生了子代羊。本实验选择了一只产绒量显著提高的转基因绒山羊（1号）及其两只子代（2号、3号）和一只产绒量未见明显改善的转基因绒山羊（4号）及其两只子代（5号、6号）进行检测，并与来自于同一细胞系的体细胞克隆绒山羊（7号）进行对比，确定外源VEGF基因在不同代次转基因绒山羊体内的遗传效率、表达量，为深入探索外源基因在转基因动物中的遗传规律提供实验依据。
　　本实验从DNA、RNA、蛋白质三个水平对转实验样本进行检测，检测结果如下:
　　(1)通过PCR鉴定，1号、2号、3号、4号羊呈转基因阳性。5号、6号羊呈转基因阴性。
　　(2)使用Glucagon基因作为内参、绝对定量PCR法对外源VEGF基因拷贝数进行检测。得到标准曲线公式:log2N=-0.3879ΔCt+0.3122(R2=0.9978, p＜0.001)计算得到各转基因绒山羊的外源基因拷贝数分别为:1号，1.235;2号，0.977;3号0.962;4号，1.884。1号、2号、3号羊外源基因为单拷贝，4号羊为双拷贝。
　　(3)以GAPDH基因作为内参，使用Real-time-PCR和western blot对外源基因表达量进行检测。结果显示，与7号体细胞克隆羊相比，转基因绒山羊皮肤组织中外源VEGF基因mRNA及蛋白表达量分别是:1号，3.53倍、2.93倍;2号，2.78倍、2.56倍;3号，0.95倍、1.24倍;4号，1.23倍、1.03倍;5号，0.78倍、0.96倍;6号，1.02倍、0.72倍。转基因绒山羊血液中外源VEGF基因mRNA及蛋白表达量分别是:1号，0.57倍、0.98倍;2号，0.78倍、0.87倍;3号，0.69倍、1.12倍;4号，0.32倍、0.94倍;5号，0.91倍、1.12倍;6号，0.89倍、0.83倍。
　　以上结果显示，外源VEGF基因在转基因绒山羊中的表达具有皮肤组织特异性，并且部分转基因绒山羊外源基因可以遗传给下一代转基因绒山羊。外源基因的表达量和遗传效率与拷贝数没有直接关系。
　　上述实验结果为今后深入研究外源基因在转基因动物中的遗传规律打下了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述 转基因动物制备方法及外源基因在转基因动物中表达和遗传稳定性

1 转基因动物制备的主要方法

1．1 显微注射法

1．2 体细胞核移植

1．3 逆转录病毒感染法

1．4 胚胎干细胞法

1．5 人工酵母染色体(YAC)法

1．6 精子载体法

2 外源基因在转基因动物中表达和遗传的稳定性

2．1 位置效应

2．2 外源基因的表观遗传学修饰

2．3 外源基因遗传的稳定性

3 结语

第二章 VEGF转基因绒山羊阳性鉴定及拷贝数测定

1 实验材料

1．1 实验仪器

1．2 实验试剂与耗材

1．3 实验材料

2 实验方法

2．1 PCR转基因阳性鉴定

2．2 绝对定量PCR法检测转基因绒山羊外源基因拷贝数

3 实验结果

3．1 PCR鉴定结果

3．2 绝对定量PCR检测结果

4 讨论

第三章 VEGF转基因绒山羊外源基因表达量检测

1 实验材料

1．1 主要仪器

1．2 实验试剂与耗材

1．3 实验液体配制

2 实验方法

2．1 Real-time-PCR检测皮肤及血液RNA表达量

2．2 Western blot检测皮肤及血液VEGF蛋白表达量

3 实验结果

3．1 Real-time-PCR检测结果

3．2 Western blot检测结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢