野大豆碱胁迫转录谱与基因组整合分析

摘要

松嫩平原西部地区是世界三大碱土集中分布区之一，面积高达373万h㎡。在这样的土壤环境下，植物遭受着钠离子毒害、碳酸氢根离子毒害和pH升高引起的土壤物理性质变化，严重影响农业生产。迫切需要通过基因工程技术改良作物的耐碱能力。挖掘耐碱基因，揭示其分子机理，是耐碱分子育种的重要前提。野大豆可以耐受9.02的pH环境，是进行植物耐碱功能基因组学的理想材料。
　　 本研究以采自吉林省白城市盐碱地的耐碱野大豆为试材，结合基因芯片技术构建碱胁迫基因转录谱，采用生物信息学手段，结合野大豆基因组数据，分析碱胁迫应答基因的共表达特征、染色体聚簇和上游调控区特征，揭示碱胁迫应答分子机制，筛选耐碱候选基因。通过本研究，将加深对植物耐碱分子机理的认识，为作物耐碱分子育种提供基因资源和奠定理论基础。本研究的主要研究结果如下：
　　 1.野大豆碱胁迫基因转录谱的建立
　　 用50mmol/L，NaHCO3模拟碱胁迫，处理野大豆G07256，提取RNA，与Affymetrix公司的基因芯片进行杂交，获得了杂交质量高、重复性好的野大豆碱胁迫基因转录谱。该转录谱包括胁迫前和胁迫后0.5h、1h、3h、6h、12h、24h共7个时间点，根部23741个和叶部22200个转录本。
　　 采用实时荧光定量PCR技术对芯片杂交结果进行了验证。随机选择的24个基因的变化趋势与芯片结果一致，表明芯片杂交结果能够真实地反映基因的转录水平变化。
　　 2.野大豆碱胁迫应答基因的获得
　　 采用RankProd统计方法分析每两个时间点间基因表达量的差异显著性（p<0.01，pfp<0.15），筛选出在某两个时间点间发生了显著变化的基因，即碱胁迫应答基因，根部2493个，叶部2310个。通过功能富集分析发现，根中参与代谢过程基因显著为碱胁迫应答基因，叶中参与代谢过程和膜转运相关的基因显著为碱胁迫应答基因。
　　 在6h出现碱胁迫基因应答高峰。在根中，参与细胞结构建成、疾病与防御、次生代谢和转录相关途径的基因显著早期应答，在转录相关基因中富集了WRKY转录因子。在叶中，参与细胞结构建成、蛋白质合成、能量和次生代谢相关基因显著早期应答。利用碱胁迫前6h转录谱构建基因调控网络，鉴定出28个碱胁迫应答关键基因。
　　 3.野大豆碱胁迫下共表达基因及特征
　　 为揭示碱胁迫应答基因的共表达特征，采用适合短时间序列表达数据的聚类方法STEM进行了聚类分析。发现根中有11类基因，叶中有10类基因具有显著的共表达特征（p<0.001）。共表达基因通常包含类似功能的基因，上游调控区具有共同的调控元件。共表达特性与其在基因组上的分布不存在相关性。发现共表达基因启动子中有21个motif对基因的共表达起重要作用，其中有12个是已知的顺式作用元件。
　　 4.碱胁迫应答miRNA筛选及调控作用分析
　　 通过将miRNA前体序列与芯片上探针组和大豆基因序列进行BLASTn比对，发现有38个转录本能够代表miRNA前体。获得了根和叶中各11条碱胁迫应答miRNA，其中7条尚未有胁迫应答的报道，为新发现的碱胁迫应答miRNA。预测miRNA靶基因，发现碱胁迫应答的miRNA主要通过调控转录因子和激酶基因影响植物的碱胁迫应答。
　　 5.野大豆耐碱候选基因筛选
　　 通过碱胁迫应答基因与分子标记的关联分析，发现了1个功能未知基因和1个具有亮氨酸拉链和丝苏氨酸磷酸转移酶活性的基因位于耐盐碱分子标记附近。根据基因的碱胁迫应答情况及功能注释，从碱胁迫应答基因中筛选出2个耐盐碱分子标记附近基因，435个有明确结构域且尚未在生物学实验中确定基因功能的基因，和9个野大豆物种特异性的功能未知基因，作为下一步耐盐碱基因工程研究的候选基因资源。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS英文目录

1 引言

1.1 研究的目的和意义

1.2 文献综述

1.2.1 盐碱胁迫及植物耐盐碱机理

1.2.2 植物耐盐碱组学研究

1.2.3 基因转录谱数据挖掘方法

1.2.4 大豆和野大豆基因组测序进展

1.3 课题来源与本论文的主要研究内容

1.3.1 本研究课题的来源

1.3.2 本论文的主要研究内容

1.3.3 本研究的特色及创新点

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 芯片材料

2.1.3 试剂及耗材

2.1.4 数据库

2.1.5 生物软件

2.2 方法

2.2.1 植物材料处理及芯片杂交

2.2.2 芯片杂交结果的realtime-PCR验证

2.2.3 芯片杂交数据预处理

2.2.4 碱胁迫应答基因筛选

2.2.5 碱胁迫应答基因聚类分析

2.2.6 基因功能注释及富集分析

2.2.7 基因的染色体定位

2.2.8 基因上游调控区分析

2.2.9 miRNA及靶基因预测

2.2.10 基因调控网络构建及分析

3 结果与分析

3.1 野大豆碱胁迫基因转录谱构建

3.1.1 芯片质量以及杂交结果的可靠性分析

3.1.2 可靠探针组的获得

3.1.3 野大豆碱胁迫基因转录谱获得

3.1.4 野大豆碱胁迫基因转录谱数据库构建及网页编制

3.2 芯片杂交结果的realtime-PCR验证

3.2.1 用于realtime-PCR验证的基因及引物

3.2.2 realtime-PCR标准曲线绘制

3.2.3 real-time PCR扩增结果及与芯片结果一致性评价

3.3 野大豆碱胁迫应答基因获得

3.3.1 各时间点差异基因筛选

3.3.2 差异基因数量变化趋势

3.3.3 碱胁迫与其他非生物胁迫应答基因数量变化趋势对比

3.3.4 差异基因功能富集分析

3.3.5 碱胁迫应答基因染色体定位

3.4 野大豆碱胁迫早期应答基因调控网络获得

3.4.1 碱胁迫早期应答基因的功能分析

3.4.2 碱胁迫早期应答基因调控网络构建

3.4.3 野大豆碱胁迫早期应答关键基因

3.5 野大豆碱胁迫共表达基因特征

3.5.1 胁迫应答基因STEM聚类分析

3.5.2 共表达胁迫应答基因功能富集分析

3.5.3 共表达胁迫应答基因上游调控区特征分析

3.5.4 共表达胁迫应答基因染色体定位

3.6 野大豆miRNA在碱胁迫下的表达模式

3.6.1 miRNA宿主基因预测

3.6.2 野大豆碱胁迫应答miRNA及其应答模式

3.6.3 野大豆miRNA靶基因预测

3.6.4 野大豆碱胁迫应答miRNA、转录因子及激酶调控网络建立

3.7 已知耐盐碱分子标记相关基因的碱胁迫应答模式

3.7.1 已知耐盐碱分子标记相关基因

3.7.2 碱胁迫应答的耐盐碱分子标记相关基因

3.8 野大豆耐碱基因工程候选基因筛选

3.8.1 野大豆碱胁迫早期应答关键基因

3.8.2 野大豆碱胁迫应答功能未知基因

3.8.3 野大豆碱胁迫应答物种特异基因

4 讨 论

5 结 论

致谢

参考文献

附 录

攻读学位期间发表的学术论文