醋酸和乳酸对酵母细胞凋亡及相关基因表达的影响研究

摘要

酵母是人类生产生活中广泛存在的微生物，因其自身的特征和优点使其在现代工业中除用于酿酒外，还用于生产甘油、食用酵母、有机酸、酶制剂等。工业生产和实验研究中很多因素可引起酵母凋亡，自酵母凋亡现象被发现以来一直是学术热点问题。随着研究的深入，人们确定了酵母凋亡过程中存在与多细胞生物凋亡相似的调节各种功能的基因，酵母作为一种简单的生物模型体系，可能有助于阐明凋亡调节机制。所以研究酵母凋亡不仅对酵母的生产实践进行理论指导，同时也为阐明哺乳动物凋亡的调节机制提供帮助。
　　 醋酸是酿酒酵母执行酒精发酵的正常终产物，当培养基中达到一定的醋酸浓度时，醋酸可引起酵母细胞以凋亡的形式进行死亡。乳酸也是某些特殊酵母发酵的正常终产物，在酿造啤酒时，乳酸可起调节pH值促进糖化，调节啤酒风味，提高啤酒质量，但乳酸能否引起酵母的凋亡还未见报道。所以，研究醋酸和乳酸引起酵母凋亡及其对某些相关基因的表达变化的影响对实践生产有指导意义，同时也可为凋亡通路的深入研究做铺垫。
　　 本实验向酵母细胞生长到指数初期（OD600=06-0.9）的YPD酵母培养基中添加不同终浓度（40mM，80mM，120mM）的醋酸和不同终浓度（200mM，250mM，300mM）的乳酸处理200分钟，选择中间终浓度的醋酸（80mM）和乳酸（250mM）处理酵母细胞不同时间（120min，200min，260min），通过美兰染色和DAPI与TUNEL染色检测酵母细胞的死亡率和凋亡率，通过RT-PCR检测某些与凋亡相关基因的表达变化，为更深入的研究酵母凋亡通路做铺垫。
　　 实验结果显示：
　　 1.通过美兰染色计数结果显示，醋酸处理的酵母细胞，随着醋酸浓度的增加和处理时间的延长，酵母细胞的死亡率逐渐增加，乳酸处理的酵母细胞，随着乳酸浓度的增加，酵母细胞的死亡率随之增加，但随着时间的延长，死亡率并无改变。
　　 2.通过TUNEL染色结果显示，醋酸引起酵母细胞死亡是以凋亡的形式进行，40mM终浓度醋酸处理200分钟可引起25％左右的凋亡，当醋酸终浓度达到120mM时凋亡达到最大在80％以上。80mM的终浓度醋酸处理120分钟，约20％以上的细胞凋亡，当时间延长到260分钟时，凋亡达到最大约80％以上。所以醋酸诱导的酵母细胞凋亡具有浓度和时间依赖性。
　　 3.通过TUNEL染色结果显示，乳酸引起酵母细胞死亡是以凋亡的形式进行，200mM终浓度乳酸处理200分钟可引起25％左右的凋亡，当乳酸终浓度达到300mM时凋亡达到最大在80％以上。250mM的终浓度乳酸分别处理酵母120、200、260分钟所发生凋亡率都在60％左右，并没有显著变化。所以乳酸诱导酵母细胞凋亡具有浓度依赖性，但未见时间依赖性。
　　 4.通过RT-PCR检测与凋亡相关的一些基因表达显示，随着醋酸和乳酸引起酵母凋亡的增加，Fis1、Bir1、SOD1、SOD2的基因表达随之降低，而Yca1、Nma111、Nuc1、Aif1、Ndi1的基因表达没有显著变化，基本保持不变。
　　 以上结果表明：醋酸和乳酸都可引起酵母凋亡，醋酸引起的酵母凋亡具有剂量时间依赖性，而乳酸引起的酵母凋亡只有剂量依赖性。通过RT-RCP检测到二者引起的凋亡上存共同点，随着凋亡程度加强Fis1、Bir1、SOD1、SOD2随之降低，但具体是怎样的通路在起作用还需更深入研究。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 引言

1.1 细胞凋亡概论

1.1.1 细胞凋亡的定义

1.1.2 动物细胞凋亡

1.2 酵母细胞凋亡

1.2.1 酵母细胞凋亡的研究背景及意义

1.2.2 酵母细胞凋亡特征

1.2.3 醋酸和乳酸

1.3 引起酵母细胞凋亡的影响因素

1.3.1 内源诱导的酵母细胞凋亡

1.3.2 生理条件下的凋亡

1.3.3 外源刺激诱导的酵母细胞凋亡

1.3.4 异源基因表达诱导的酵母细胞凋亡

1.4 酵母细胞凋亡的作用机制

1.4.1 酵母细胞凋亡与线粒体的作用

1.4.2 酵母细胞凋亡与YCA1的作用

1.4.3 酵母细胞凋亡与ROS的作用

1.5 目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料、器材与试剂

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验主要器材

2.1.3 实验试剂

2.1.4 主要药品及其配制

2.2 实验方法

2.2.1 酵母细胞培养

2.2.2 扩大培养及生长曲线的测定

2.2.3 酵母菌株的实验处理

2.2.4 细胞存活率测定

2.3 酵母凋亡的检测

2.3.1 DAPI染色法

2.3.2 PI染色法

2.3.3 TUNEL染色法

2.4 RT-PCR法检测基因表达量变化

2.4.1 引物设计

2.4.2 酵母总RNA的提取步骤

2.4.3 酵母总RNA中DNA的消化

2.4.4 逆转录

2.4.5 聚合酶链式反应

2.5 数据统计及分析

3 结果与分析

3.1 酵母细胞的形态与生长曲线

3.2 醋酸和乳酸处理酵母细胞的死亡率情况

3.2.1 醋酸引起酵母细胞死亡率的情况

3.2.2 乳酸引起酵母细胞死亡率的情况

3.3 醋酸引起的酵母凋亡情况

3.3.1 醋酸处理酵母细胞后DAPI染色结果

3.3.2 醋酸处理酵母细胞的透膜率情况

3.3.3 醋酸处理酵母细胞后的TUNEL染色结果

3.4 醋酸处理酵母细胞后凋亡相关基因RT-PCR检测结果

3.5 乳酸引起的酵母凋亡情况

3.5.1 乳酸处理酵母细胞后DAPI染色结果

3.5.2 乳酸处理酵母细胞后透膜率情况

3.5.3 乳酸处理酵母细胞后的TUNEL染色结果

3.6 乳酸处理酵母细胞后凋亡相关基因RT-PCR检测结果

4 讨论

4.1 酵母细胞的生长

4.2 醋酸引起酵母凋亡

4.3 乳酸引起酵母凋亡

4.4 酵母凋亡的分子机制

5 结论

致 谢

参考文献

图版及说明

攻读硕士期间发表的学术论文