H5N1亚型禽流感病毒HA基因在大肠杆菌中的表达与纯化

摘要

禽流感（Avian Influenza）是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的感染和/或疾病综合征。此病呈世界性流行，给养禽业造成巨大的经济损失。血凝素蛋白（HA）是禽流感病毒最重要的结构蛋白，占囊膜蛋白的90％，是诱导体液免疫的主要靶抗原，并且还能诱导细胞毒性T细胞作用，另外HA各部分的抗原性和免疫原性也有差别，研究表明，HA上游基因的免疫原性以及抗原性强于下游。
　　 本研究利用RT-PCR技术扩增和克隆了H5N1亚型禽流感病毒的上游（HAf）和中游（HAm）基因。将HAf和HAm基因片段与原核表达载体pET-32a连接，利用E.coli DH5α感受态细胞进行克隆和扩增，经PCR鉴定，证明成功构建了融合表达质粒32a-HAf和32a-HAm。将构建好的融合表达质粒转化到E.coli Rosetta感受态细胞中，在1mmol/L的IPTG诱导下，HAf基因得到了可溶性表达，分子量为40kD，HAm基因的表达产物则以包涵体形式存在，大小为56kD。
　　 本研究为了使HAm的包涵体能够得到有效的利用，对包涵体进行了变性处理，变性后采用梯度透析复性。在透析缓冲液的浸泡下，4℃进行梯度复性，每12h换液一次。SDS-PAGE电泳表明包涵体复性效果良好。
　　 复性后HAm蛋白与HAf可溶性蛋白分别经Ni-HTA亲和层析柱进行纯化处理，分离目的蛋白。经Western-blot免疫印记分析，HAf和HAm融合蛋白与H5亚型AIV阳性血清发生了特异性反应，但HAf重组蛋白的抗原性不强，而HAm重组蛋白具有良好的抗原性。
　　 本研究为了以后进一步试验作准备，将纯化后的HAm重组蛋白作为包被抗原包被酶标板，通过方阵滴定法初步建立了检测禽流感病毒H5亚型阳性血清的间接ELISA方法，结果抗原最佳包被浓度为25μg/ml，血清最佳稀释度为1:160。通过特异性试验证明得到的重组蛋白具有较好的型特异性。
　　 本研究通过克隆和转化，分别得到了HA不同片段的可溶性表达和包涵体表达，并通过尿素的变性复性处理和Ni柱纯化操作得到了比较纯的目的蛋白，证明这种表达方法可行，为抗原性和特异性研究奠定了基础，为进一步摸索HA部分基因的可溶性表达方法提供了一定的依据。

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 前言

1.1 流感发生的历史

1.2 禽流感病毒概论

1.2.1 病毒概述

1.2.2 流感病毒

1.2.3 A型流感病毒的分型

1.2.4 A型流感病毒结构

1.2.5 A型禽流感病毒主要结构蛋白及生物学功能

1.3 H5N1亚型禽流感病毒研究进展

1.3.1 H5N1亚型禽流感概况

1.3.2 H5N1亚型禽流感病毒对禽类的影响

1.3.3 H5N1亚型禽流感病毒对人的感染

1.3.4 禽流感的防制

1.3.5 禽流感疫苗免疫研究进展

1.4 研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 载体与菌株

2.1.2 禽流感病毒

2.1.3 扩增引物

2.1.4 主要试剂

2.1.5 常用溶液配方

2.1.6 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 AIV HA基因的PCR扩增

2.2.2 HAf、HAm基因克隆载体的构建

2.2.3 原核表达载体的构建

2.2.4 HA基因的原核表达

2.2.5 扩大培养与可溶性分析

2.2.6 表达蛋白的纯化

2.2.7 Western-blot免疫印迹

2.2.8 间接ELISA

3 结果与分析

3.1 目的基因的扩增

3.2 HAf、HAm克隆载体的构建

3.3 HAf、HAm表达载体的构建

3.4 HAf、HAm在Rosetta菌中的表达

3.5 HAf和HAm的扩增和破碎

3.6 HAm包涵体的洗涤、溶解

3.7 表达产物的纯化回收

3.8 Western-blot分析

3.9 iHA-ELISA 方阵滴定结果

3.10 ELISA特异性试验

4 讨论

4.1 HA基因的分段克隆与扩增

4.2 提高可溶性高效表达的尝试

4.3 表达系统和表达菌株的选择

4.4 HAf和HAm蛋白的原核表达

4.5 Westen-blot检测重组蛋白的抗原特异性

4.6 iHA-ELISA的初步建立

5 结论

致 谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文