我国部分地区牛支原体病原的分离鉴定及ρ81基因序列分析和蛋白表达

摘要

牛支原体（Mycoplasma boris，M.bovis）主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎等。一旦牛场中存有M.bovis就很难消灭，它将会不断地从老年动物传染给新生牛或新引进的牛，而引起持续感染。目前已经在欧洲和北美引起广泛的流行并造成严重的经济损失。我国于2008年首次发生牛支原体感染的病例，已有部分省份陆续出现报道。
　　 本研究首先对湖北省患有牛呼吸道疾病的肺脏组织病料进行了病原的分离，对得到的分离物进行生化特性鉴定、16S rRNA基因序列比较、特异性PCR鉴别实验和血清学实验，结果显示，在40×显微镜下可以清楚看到分离物Hubei-1的菌落成明显的“油煎蛋状”，具有典型的支原体菌落特征；其生化特性与牛支原体完全吻合。16S rRNA基因序列比较结果显不，Hubei-1的16S rRNA序列与牛支原体标准株PG45株同源性为99.3％，与无乳支原体（Mycoplasma agalactiae，M.agalactiae）PG2株的同源性为99％。用特异性引物P3/P4进行PCR扩增，可以扩增出1.9 kb大小的片段，而无乳支原体则无扩增片段。将扩增出的片段克隆至pMD18-T-Vector，送上海生工进行测序。测序结果与参考Genbank中登录的M.bovis PG45株进行比对，证明了分离物是牛支原体，此次为我国首次分离得到牛支原体。此后，又对其它7个省份送检的牛肺脏用同样的方法进行病原的分离鉴定，得到7株分离株，结果证明病原均为牛支原体。
　　 实验利用PCR技术从8株支原体分离株扩增p81基因，克隆到pMD18-T-Vector，转化到DH5α感受态细胞中送往上海生物工程技术公司进行DNA测序。结果表明p81基因全长2097 bp，我国分离得到的8株M.bovis分离株之间的同源性为99.4～99.9％，与PG45株同源性94.6％～94.9％，与无乳支原体PG2株的同源性为73.8％～74％。我国分离的M.bovis株高度保守，变异率低。M.bovis种内高度保守，种间差异较大，p81基因可以作为诊断M.bovis的靶基因，为M.bovis的鉴别诊断提供依据。
　　 测序结果还显示p81基因在第165、684、1447、1674位密码子TGA在支原体编码色氨酸而在大肠杆菌是终止密码子，TGG在大肠杆菌中编码色氨酸。设计四对突变引物在此四个位置进行定点突变，将TGA突变为TGG，将突变后的p81基因截短成四部分，经BamH I和SalⅠ双酶切后克隆到同样酶切处理的pET-30a和pET-32a中，经PCR、酶切鉴定后的重组质粒进行诱导表达，得到4段重组蛋白。分别对重组蛋白进行Western blotting和间接ELISA试验，结果证明，4段重组蛋白在NC膜上均无反应条带，而ELISA结果也显示，只有用P81-3-1455蛋白作为抗原进行试验时，P/N>2.1，证明反应成立，可以用于进行血清学检测。但是却与PS2（牛传染性胸膜肺炎国际标准血清）、M.agalactiae PG2阳性血清有交叉反应。不能用于牛支原体和无乳支原体、牛肺疫的鉴别诊断。
　　 本研究成功鉴定出M.bovis病原，对其p81基因进行了序列分析、进化树的对比，对p81基因进行了截短克隆并成功表达出4段重组蛋白，为我国M.bovis感染的的诊断提供了理论依据和基础，填补了我国M.bovis基因及蛋白研究的空白。

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 引言

1.1 病原学

1.1.1 牛支原体的分类与特征

1.1.2 牛支原体的基本特性

1.2 牛支原体基因及蛋白的研究进展

1.2.1 Vsp基因及Vsps蛋白

1.2.2 p68基因及P68蛋白

1.2.3 p81基因及P81蛋白

1.2.4 P40*蛋白

1.2.5 pMB67蛋白

1.2.6 其它蛋白

1.3 流行病学研究

1.3.1 牛支原体的寄居及排泄

1.3.2 牛支原体的传播方式

1.3.3 牛支原体的流行及引起的经济损失

1.3.4 分子流行病学

1.4 临床症状

1.5 牛支原体的诊断与防治

1.5.1 诊断

1.5.2 治疗

1.5.3 防控措施

1.6 研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病料、菌株、质粒和实验动物

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验设备

2.1.5 实验中主要溶液及其配制

2.2 方法

2.2.1 病原的分离与鉴定

2.2.2 p81基因的克隆及测序

2.2.3 牛支原体阳性血清的制备

2.2.4 P81蛋白的截短克隆与表达

2.2.5 重组蛋白的Western blotting

2.2.6 重组蛋白的间接ELISA实验

2.2.7 交叉性实验

3 结果与分析

3.1 病原的分离与鉴定结果

3.1.1 病原的分离

3.1.2 病原的生化实验结果

3.1.3 PCR鉴定结果

3.1.4 16S rRNA序列分析与比较

3.1.5 血清学结果

3.2 p81基因的克隆鉴定结果

3.2.1 p81基因的扩增

3.2.2 重组质粒pMD-18T-P81quan的酶切鉴定结果

3.2.3 p81基因的序列分析

3.3 目的基因PCR扩增结果

3.3.1 p81-3-687基因的PCR的扩增结果

3.3.2 p81-3-1455基因的PCR扩增结果

3.3.3 p81-684-1455基因的PCR扩增结果

3.3.4 p81-1447-2097基因的PCR扩增结果

3.4 重组质粒的鉴定结果

3.4.1 重组质粒pET-30a-P81-3-687的双酶切鉴定结果

3.4.2 重组质粒pET-32a-P81-3-1455的双酶切鉴定结果

3.4.3 重组质粒pET-30a-P81-684-1455的双酶切鉴定结果

3.4.4 重组质粒pET-32a-P81-1447-2097的双酶切鉴定结果

3.5 融合蛋白的诱导表达结果

3.5.1 重组蛋白P81-3-687的诱导表达及纯化

3.5.2 重组蛋白P81-3-1455的诱导表达

3.5.3 重组蛋白P81-684-1455的诱导表达

3.5.4 重组蛋白P81-1447-2097的诱导表达

3.6 重组蛋白的Western blotting结果

3.7 蛋白浓度的测定

3.8 重组蛋白的间接ELISA结果

3.9 交叉反应结果

4 讨论

4.1 病原的分离与鉴定

4.2 p81基因的选择

4.3 p81基因的克隆

4.4 蛋白的截短克隆与表达

4.4.1 pET载体的选择

4.4.2 诱导条件的优化

4.4.4 包涵体蛋白的纯化

4.5 重组蛋白的特异性分析

4.6 重组蛋白的ELISA实验

5 结论

致 谢

参考文献

附 录

攻读硕士学位期间发表的学术论文