表达RVERA株G蛋白重组新城疫病毒的构建及免疫原性研究

摘要

狂犬病(Rabies)又名恐水症,是由狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)引起的,侵害中枢神经系统的急性病毒性人兽共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病,一旦发病,病死率高达100％。狂犬病主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。近年来,我国狂犬病的发病率呈不断上升之势,仅次于印度居全球第二位。流行病学调查表明:95％以上的人狂犬病病例是因为与患病或带毒的犬或猫直接接触而引起的。
　　 狂犬病病毒糖蛋白(Rabies Virus Glycoprotein,RVG)是目前人们在狂犬病病毒结构和免疫学方面研究最为深入的蛋白。RVG是一种跨膜蛋白,以三聚体的形式定位于病毒的表面,构成表面的纤突,是病毒的主要表面抗原。RVG是病毒与宿主细胞结合的配体,能与细胞表面受体互作,介导病毒与靶细胞的结合。RVG不但与病毒的毒力、致病性密切相关,而且是狂犬病病毒的有效的保护性抗原,可诱导机体产生中和抗体和刺激细胞免疫,保护机体抵抗病毒感染。
　　 负链RNA病毒反向遗传操作系统(RGS)的成功建立使新城疫病毒(NDV)成为最具应用价值的活病毒表达载体。经过多年的临床应用,表现出非凡的优势:NDV遗传稳定,毒株间发生重组及毒力返强的可能性极小;NDV在哺乳动物和人类中仅发生一过性感染,对人类没有潜在危险;NDV具有高滴度的鸡胚生长特性,生产成本低廉,便于规模化生产。NDV作为疫苗载体具有广阔的应用空间和巨人的经济意义。
　　 在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建表达RVERA株糖蛋白的重组新城疫病毒rL-RVG,并探索rL-RVG对小鼠免及比格犬的免疫原性。利用RT-PCR技术,从狂犬病病毒ERA疫苗株上得到狂犬病病毒的糖蛋白基因,将其克隆到载体pBRN-FL-PmeI上,构建了表达狂犬病病毒糖蛋白重组新城疫病毒全长cDNA克隆pBRN-FL-RVG。利用磷酸钙转染法,在辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L的共同作用下,拯救重组病毒rL-RVG。RT-PCR检测证实重组病毒rL-RVG基因组中含有RVG基因;WesternBlot和IFA检测结果均表明RVG基因在新城疫载体中得到了正确、稳定的表达;大剂量接种BALB/c小鼠不会引起小鼠发病和生长阻滞,并能诱导出高水平ERA特异中和抗体反应;加强免疫后可有效抵御致死剂量RV街毒对BALB/c小鼠的攻击;持续监测比格犬ERA特异中和抗体水平表明具有良好的免疫原性。重组病毒rL-RVG有望成为防制狂犬病更加安全、有效的,新型重组基因工程活载体疫苗。