表达重症急性呼吸综合征病毒刺突蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

摘要

重症急性呼吸综合征(SARS)是一种急性、发热并伴有呼吸系统甚至多脏器感染的人兽共患病.虽然自2004年以来未见SARS感染病例相关报道,但是2019年12月我国湖北省武汉市暴发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情表明SARS冠状病毒(SARS-CoV)或者类SARS冠状病毒(SARSL-CoV)在人群中再次大面积流行的可能性极高.本研究首先构建了表达SARS-CoV刺突蛋白(S蛋白)的全长cDNA克隆pBRN-FL-SARS-CoV-S,并利用新城疫病毒(NDV)LaSota疫苗株反向遗传操作系统,拯救出表达SARS-CoV S蛋白的重组病毒rLa-SARS-CoV-S并鉴定.将rLa-SARS-CoV-S以MOI 0.01的剂量感染BHK-21细胞36 h后分别通过western blot和激光共聚焦试验对SARS-CoV S蛋白进行检测,结果显示S蛋白在感染的细胞中能正确表达并准确定位于细胞膜上.将rLa-SARS-CoV-S以1×104 EID50的剂量接种10日龄的SPF鸡胚后在不同时间点收集尿囊液并测定EID50,病毒的生长动力学曲线显示rLa-SARS-CoV-S能够在鸡胚中高滴度生长,与亲本病毒一致.将rLa-SARS-CoV-S和亲本病毒10倍倍比稀释后接种10日龄的SPF鸡胚并记录每个鸡胚的死亡时间,按病毒最高稀释度引起鸡胚的死亡时间计算鸡胚平均致死时间(MDT),结果显示rLa-SARS-CoV-S的MDT为112.8 h,NDV LaSota的MDT为96 h,说明该重组病毒仍然保持NDV LaSota疫苗株的低致病力特性.将rLa-SARS-CoV-S和NDV LaSota分别以5×106 EID50的剂量通过肌肉注射接种6周龄的BALB/c小鼠并在第21 d加强免疫,同时设置PBS对照组.小鼠安全性试验结果显示接种rLa-SARS-CoV-S的小鼠全部存活并且无任何临床症状,体质量增长情况与NDV LaSota组及对照组保持一致;免疫后21 d和42 d对小鼠采血制备血清,通过ELISA检测小鼠体内针对SARS-CoV S蛋白的IgG抗体水平,结果显示在初免和加强免疫后该重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,并且抗体水平可以维持较长一段时间.本研究结果表明rLa-SARS-CoV-S具有作为SARS-CoV候选疫苗的潜在价值,同时为研发SARS-CoV-2疫苗提供思路.