乳脂前体物对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞结构蛋白质组学的影响

摘要

乳成分的含量及组成直接影响了牛乳的品质。本研究通过比较乳脂前体对乳腺上皮细胞泌乳能力和其对乳脂合成关键酶基因表达情况的影响，筛选出既能高效提高乳脂分泌能力又可以对乳脂合成关键酶基因起到重要调控作用的乳脂前体的最佳浓度，为日粮中脂肪酸的添加提供了可靠的数据参考。在此基础上，通过亚细胞器蛋白质组学的研究策略及技术手段研究乳脂前体对乳腺细胞亚细胞器蛋白质组表达的影响，希望能够筛选出在乳脂的合成及代谢过程中起到一定调控作用的功能蛋白。参考已知的乳脂合成信号通路，分析筛选出的差异蛋白点与信号通路之间的联系，为解释泌乳发生机制和机理提供了亚细胞层面的信息。筛选出对奶牛乳腺发育和泌乳有重要功能的基因，对于提高乳品质、促进奶业发展具有重要意义。
　　 本文通过实验室趋于成熟的奶牛上皮细胞体外培养方法，获得了高纯度且生理功能良好的奶牛乳腺上皮细胞；应用CASY细胞分析仪检测乳脂前体物对乳腺上皮细胞增殖及细胞活力的影响；利用半自动生化分析仪、HPLC液相色谱及RT-PCR分别检测添加不同浓度乙酸钠及β-羟基丁酸钠后，奶牛乳腺上皮细胞分泌乳脂、乳糖及β-酪蛋白能力的影响以及乳腺细胞当中与乳脂合成相关的酶基因表达的影响；优化亚细胞器蛋白提取方法进行2-DE凝胶电泳实验，利用硝酸银染色获得分辨率高、重复性好的蛋白电泳凝胶图谱；结合质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定乳脂前体物对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞器蛋白质组的差异影响；应用荧光定量PCR验证差异蛋白在不同泌乳水平奶牛乳腺组织中的表达情况，从而初步探索其乳脂合成机理。实验结果表明：⑴乳脂前体对奶牛乳腺上皮细胞分泌乳脂、乳糖、β-酪蛋白具有不同程度的影响，乳脂乳糖提高均显著(P<0.05)，β-酪蛋白mRNA表达量均有显著下降；RT-PCR技术分别检测了4个乳脂合成关键性酶基因转录水平上的表达差异；最终筛选出乙酸钠和β羟基丁酸钠对乳腺细胞作用的最佳浓度，分别为4mM和0.75mM。⑵建立并优化了乳腺上皮细胞亚细胞器蛋白双向电泳的实验方法，得到了蛋白斑点多，重复性良好的双向电泳图谱，为后续乳腺上皮细胞亚细胞器蛋白质组的研究提供了有效的手段。⑶通过添加β-羟基丁酸钠作用于奶牛乳腺上皮细胞，应用双向电泳结合质谱技术分析，成功筛选并鉴定了具有重要意义的4种差异蛋白，分别为：Alpha-enolase(ENO1)、Glucosidase(GANAB)、Plastin3(PLS3)及Actin-related protein2/3 complex subunit2(ARPC2)，RT-PCR技术鉴定这4种蛋白基因在转录水平上表达的差异；但添加乙酸钠后，乳腺细胞亚细胞器蛋白质组中并未发现有明显差异的蛋白表达，其机理还有待进一步研究。⑷通过RT-PCR的方法验证这4个基因在不同泌乳奶牛乳腺组织中表达的差异性，表明这4个基因与奶牛乳腺乳脂合成具有潜在的关联。本研究首次在乳腺细胞的研究领域里建立了蛋白质组学的研究方法。为阐释乳脂的合成代谢提供了帮助，有助于进一步揭示奶牛乳腺上皮细胞泌乳机制。提示乳腺在对乳蛋白质前体物、乳糖前体物和乳脂前体物的摄取利用和乳成分合成方面存在理想平衡模式，值得进一步研究。