HMME联合He-Ne激光对犬乳腺肿瘤细胞线粒体膜电位和ATP酶的影响

摘要

光动力学疗法是激光技术、光导技术、光信息处理技术、生物光化学技术和现代医学技术有机结合的产物,是肿瘤治疗的新技术。它与传统手术、放疗和化疗三大治疗肿瘤疗法相比,有极大的优越性。犬乳腺肿瘤是兽医临床常见的一种肿瘤性疾病。犬乳腺肿瘤与人类乳腺癌有很多相似之处,是作为人乳腺肿瘤研究的出色的模型。HMME联合632.8nm的He-Ne激光诱导体外犬乳腺肿瘤细胞凋亡,并取得了明显效果。但凋亡的机理仍存在许多问题有待深入研究。线粒体途径是细胞凋亡的重要途径之一,光动力学疗法通过光敏剂产生活性氧诱导细胞凋亡,HMME-PDT是否造成犬乳腺肿瘤细胞线粒体损伤至今尚未报道,线粒体在HMME-PDT治疗中损伤程度及在诱导凋亡中所起的作用还不清楚。
　　 本实验选用自然发生乳腺肿瘤病例的转移灶分离培养的细胞CHMm,用HMME联合632.8nm的He-Ne激光体外作用CHMm细胞。采用倒置显微镜观察HMME-PDT处理后犬乳腺肿瘤细胞形态学变化;用TUNEL末位法检测细胞凋亡;考马斯亮蓝检测细胞内总蛋白的含量:采用荧光显微镜检测HMME在细胞内的分布:采用Regand染色法对线粒体进行染色,光镜下观察HMME-PDT对犬乳腺肿瘤细胞线粒体损伤情况;通过提取线粒体DNA与琼脂糖凝胶电泳观察HMME-PDT对犬乳腺肿瘤细胞线粒体DNA损伤情况;通过线粒体膜电位变化检测、线粒体Ca2+转运能力的测定及线粒体ATP酶活性的检测,观察线粒体结构和功能的损伤情况。
　　 实验结果显示:HMME-PDT能诱导犬乳腺肿瘤细胞出现空泡化,使细胞脱落死亡,并具有时间依赖性。单独光敏剂和单独激光在不同程度的抑制细胞的增殖,呈现增殖缓慢,密度增加较小。HMME-PDT实验组处理后,犬乳腺肿瘤细胞出现明显的凋亡形态;细胞核浓染,固缩,出现致密浓染的颗粒状强荧光,3h后出现统计学差异(P＜0.05),6h后差异极显著(P＜0.01)。HMME主要分布在细胞质中,细胞核周围区域荧光较强,光敏剂分布较多。细胞质中线粒体被染成蓝色颗粒,线粒体聚集越多染色越深,HMME-PDT实验组从3h开始细胞质染色逐渐变浅,细胞质被染色的颗粒成分随时间增加,越来越少,整个细胞着色变浅,细胞数目不断降低。经HMME-PDT处理后线粒体DNA损伤出现断裂,在100～200bp之间出现断裂的条带,实验组从3h开始亮度开始增强,条带变宽,并在24到最亮。流式细胞仪检测线粒体膜电位降低:实验组Ca2+摄取能力逐渐降低,Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPaseh活性都显著降低。
　　 通过本实验的研究得出以下结论:HMME-PDT能诱导犬乳腺肿瘤细胞质内出现空泡,细胞停止增殖并死亡脱落:单独光敏剂和单独激光对犬乳腺肿瘤的杀伤作用较弱。HMME-PDT诱导犬乳腺肿瘤细胞发生凋亡,随处理后时间延长杀伤效应增加。HMME在犬乳腺肿瘤细胞系中主要分布在细胞质中,在细胞核周围分布较多;实验组细胞代谢在逐渐减弱;HMME-PDT损伤肿瘤细胞线粒体,使线粒体数目下降,线粒体膜电位降低,线粒体Ca2+转运能力下降,线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性都显著降低,导致线粒体功能损伤。