HMME-PDT诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡形态学及Caspase-3、Caspase-8活性变化研究

摘要

犬乳腺肿瘤是兽医临床常见的一种肿瘤性疾病。犬作为人类的伴侣动物分享着人类生活的很多方面。在发病机理、肿瘤组织学特性、治疗方法及预后都与人类的乳腺肿瘤极其相似，因此用犬来作为研究乳腺肿瘤的模型对以后研究新的治疗方案尤具意义。
　　 传统的治疗癌症的手段是手术、化疗和放疗，但是传统的治疗手段常难以获得理想疗效，医学界仍在不断探索治疗恶性肿瘤的新方法。光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)是一种能诱导肿瘤细胞坏死和凋亡的细胞毒性治疗方法，是激光技术、光导技术、光信息处理技术、生物光化学技术和现代医学技术有机结合的产物，是一种非常有发展前景的能诱导细胞凋亡和坏死的肿瘤治疗方法。光动力学的作用因素包括对光敏感的物质—光敏剂、光、基质以及氧分子。光敏剂可以被病变靶组织选择性的吸收，在合适波长的光的激发下，通过能量的转换产生活性氧物质，进而造成对靶组织的损伤。
　　 血卟琳单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)是一种新型的卟琳类光敏剂，并已在基础实验和临床试验中证明了它的高效性。但目前国内HMME-PDT对乳腺癌细胞作用的研究较少。
　　 目的：本课题采用这种新型光敏剂——血卟琳单甲醚，用波长为632.8nm的He-Ne激光照射体外培养的犬乳腺肿瘤细胞，研究不同光敏剂剂量及不同激光照射剂量的光动力学作用对犬乳腺肿瘤细胞生长的影响，确定HMME-PDT对犬乳腺肿瘤细胞的凋亡率，观察及检测细胞凋亡的情况，以及检测凋亡过程中的重要参与者（钙离子，Caspase-3，Caspase-8及端粒酶）的变化，探讨HMME-PDT导致乳腺肿瘤细胞凋亡的机制。
　　 方法：实验选用自然发生乳腺肿瘤病例的转移病灶分离培养的细胞系CHMm，经传代生长性状稳定后，作为研究对象。首先用MTT法测定细胞的抑制率，确定抑制细胞生长的光敏感剂和激光照射的最佳剂量。将细胞按光照后3h、6h、12h、24h、48h分组，同时设置空白对照组，采用最佳剂量组合作用细胞，通过吉姆萨染色在倒置显微镜下观察、AO/EB染色在荧光显微镜下观察、及透射电镜下观察细胞凋亡的形态学变化；用DNA LADDER法定性检测细胞凋亡的情况；采用Annexin V-FITC／PI法，通过流式细胞仪检测细胞的凋亡率；采用Fura-2 AM(钙离子荧光探针)法检测HMME-PDT对细胞内游离钙离子的含量变化的影响；采用分光光度法检测HMME-PDT对细胞内Caspase-3及Caspase-8的变化的影响；采用TRAP-银染法检测HMME-PDT对细胞的端粒酶活性的影响。
　　 结果：
　　 1.MTT法检测发现HMME-PDT对犬乳腺肿瘤细胞株CHMm生长的有明显抑制作用，且抑制率具有剂量依赖性，结果数据分析确定，光敏感剂剂量20μg/mL和光照剂量2.8J/cm2是最佳剂量组合。
　　 2.吉姆萨染色，吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色，以及透射电镜下观察发现，HMME-PDT诱导犬乳腺肿瘤细胞CHMm凋亡，细胞呈典型的凋亡形态，并且随着HMME-PDT后时间的延长凋亡程度逐渐严重。3.HMME-PDT后细胞的DNA电泳呈典型“梯状”条带，并且随着HMME-PDT后时间的延长条带颜色逐渐加深。表示随着HMME-PDT后时间的延长，细胞凋亡程度逐渐加深。
　　 4.Annexin V-FITC／PI双染色，流式细胞仪检测实验组细胞的凋亡率逐渐升高与对照组差异极显著性，并且随着HMME-PDT后时间的延长凋亡率逐渐增加。
　　 5.实验组细胞内游离的钙离子含量逐渐增加，与对照组差异极显著，伴随凋亡程度的加深，细胞内游离钙离子含量逐渐增加。
　　 6.伴随凋亡程度的加深，实验组细胞内Caspase-3和Caspase-8活性逐渐增多，其中Caspase-8活性从3h组起与对照组差异显著，Caspase-3的活性从6h组与对照组差异显著。
　　 7.实验组用来表示细胞内端粒酶活性的凝胶电泳上显示相隔6bp的梯状条带，并且经过Image VCD凝胶成像系统扫描分析条带平均灰度值逐渐降低，与对照组差异极显著。表明伴随凋亡程度的严重端粒酶活性逐渐降低。
　　 HMME-PDT能诱导犬乳腺肿瘤细胞株CHMm凋亡，并且具有时间依赖性。HMME-PDT诱导细胞凋亡的机制与钙稳态失衡机制、Caspase级联机制（其中Caspase-8在凋亡早期起“凋亡启动者”的作用，Caspase-3在凋亡中后期起着“凋亡执行者”的作用）以及与抑制端粒酶活性机制有关。