整联蛋白alpha6、beta4介导层黏连蛋白作用调控乳腺上皮细胞

摘要

整联蛋白是一种重要的细胞黏附分子,以受体-配体结合的形式发挥作用,介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)间的相互作用。上皮组织发育和功能需要整合来自局部细胞微环境和远程激素的信号。在决定细胞命运的不同类型局部信号中,细胞黏附到ECM是最为重要的。整联蛋白是一类主要的将细胞黏附到ECM的细胞表面受体,通过细胞骨架组织细胞形状,它们也影响细胞命运的决定。整联蛋白参与细胞识别与结合、活化和信号转导,参与细胞增殖、存活、迁移、分化以及细胞的伸展和转移,是免疫引导、炎症反应、凝血、肿瘤转移、创伤愈合等一系列生理和病理过程的基础。新的观点认为整联蛋白监控细胞的外环境,进而使细胞具备了条件依赖性激素和生长因子信号的检验点。然而,对正常上皮发育机制和异常性机制的全面了解仍然是一个重要挑战,这需要清楚细胞-ECM相互作用如何影响下游生物效应,并且剖析特异性的调控方式。本研究的目的在于揭示整联蛋白α6、β4的表达和奶牛乳腺发育与泌乳之间的关系,以及催乳素(PRL)、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)和层黏连蛋白(LN)调控整联蛋白α6、β4表达的分子机制,为奶牛乳腺发育和泌乳机制的研究提供基础资料,为人工调控乳质量和乳产量提供可行的技术手段和理论支持。本研究以荷斯坦奶牛乳腺为实验材料,应用荧光定量RT-PCR、Western blotting及免疫荧光技术,检测不同发育阶段奶牛乳腺组织中整联蛋白α6、β4的表达定位;以体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞为模型,确定LN对于整联蛋白α6、β4表达的影响,及其与PRL、GH、IGF-1和IGF-2调控乳腺上皮细胞增殖和泌乳性能的串话效应。研究结果表明,整联蛋白α6、β4在奶牛乳腺发育的不同时期均有表达,但各个时期的表达量发生变化。其中,整联蛋白α6在妊娠期显著高于其他发育时期(P<0.05),妊娠中期达到峰值;整联蛋白β4在青春期和妊娠期显著高于其他发育时期(P<0.05),妊娠中期达到峰值。其相对表达量呈正相关。这与荧光定量RT-PCR结果相似,妊娠末期整联蛋白α6的相对表达量达到峰值;青春初期,整联蛋白β4的相对表达含量达到峰值。实验中用组织块培养法成功获取了泌乳期奶牛乳腺上皮细胞。LN与不同泌乳相关激素和生长因子对整联蛋白α6、β4的相对表达量有促进作用,其中GH和IGF-1处理组变化显著(P<0.05);LN对整联蛋白β4的促进作用显著(P<0.05)。MTT技术检测,结果表明LN促进整联蛋白α6、β4表达时同步诱导细胞黏附,IGF-1和IGF-2促进细胞黏附作用;整联蛋白α6、p4参与细胞增殖,而LN对细胞增殖有显著的促进作用,但在PRL和IGF-2协同作用下具有促细胞存活作用。检测乳糖、乳脂和乳蛋白合成分泌情况,结果表明整联蛋白α6、β4对奶牛乳腺细胞的乳糖、乳脂合成具有正向调控作用;PRL、GH、IGF-1和IGF-2对乳蛋白的合成有正向调控作用;而LN对乳糖、乳脂和乳蛋白合成无显著调控作用。总之,本研究从细胞-细胞外基质相互作用的角度,验证了奶牛整联蛋白家族成员α6和β4及其配体——层黏连蛋白的泌乳相关作用及其调控机制,并为奶牛乳腺发育和泌乳调控提供了新的研究方法和思路。

目录

摘要

Abstract

1 引言

1.1 乳腺发育的形态学简介

1.2 整联蛋白及其细胞外基质配体

1.3 整联蛋白及其细胞外基质配体的结构

1.3.1 整联蛋白的结构

1.3.2 细胞外基质配体的结构

1.4 整联蛋白的生物学功能

1.4.1 整联蛋白——连接细胞外基质与细胞骨架的“桥梁”

1.4.2 整联蛋白在乳腺中的表达与作用

1.4.3 整联蛋白介导的信号通路

1.4.4 奶牛乳腺内分泌调控与整联蛋白作用的关系

1.5 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 整联蛋白α6和β4的免疫荧光共定位检测

2.1.1 样品采集

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂及配制

2.1.4 实验方法

2.2 奶牛乳腺组织各时期整联蛋白α6和β4的mRNA检测

2.2.1 实验材料

2.2.2 主要仪器

2.2.3 主要试剂及配制

2.2.4 RNA提取

2.2.5 RNA检测

2.2.6 荧光定量RT-PCR检测mRNA的表达

2.3 奶牛乳腺组织各时期整联蛋白α6和β4 Western blotting检测

2.3.1 实验材料

2.3.2 主要仪器

2.3.3 主要试剂及配制

2.3.4 实验方法

2.4 奶牛乳腺上皮细胞培养及鉴定

2.4.1 实验材料

2.4.2 主要仪器

2.4.3 主要试剂及配置

2.4.4 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养、传代及纯化

2.4.5 奶牛乳腺上皮细胞的冻存

2.4.6 奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白18鉴定

2.5 不同泌乳激素和生长因子对奶牛乳腺上皮细胞中整联蛋白α6和β4表达的影响

2.5.1 免疫荧光共定位检测整联蛋白α6和β4

2.5.2 RT-PCR检测整联蛋白α6和β4mRNA水平的表达

2.6 不同泌乳激素和生长因子对奶牛乳腺上皮细胞增殖和黏附的影响

2.6.1 实验材料

2.6.2 主要试剂与仪器

2.6.3 实验分组

2.6.4 不同泌乳激素和生长因子对奶牛乳腺上皮细胞黏附的检测

2.6.5 不同泌乳激素和生长因子对奶牛乳腺上皮细胞增殖的检测

2.7 不同泌乳激素和生长因子对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能检测

2.7.1 乳糖含量的检测

2.7.2 乳脂含量的检测

2.7.3 乳蛋白含量的检测

2.8 数据处理及统计分析

3 结果

3.1 奶牛乳腺发育不同时期整联蛋白α6和β4的表达定位

3.2 整联蛋白α6和β4在奶牛乳腺发育不同时期mRNA表达量变化

3.2.1 奶牛乳腺组织各时期RNA提取鉴定结果

3.2.2 RT-PCR检测整联蛋白α6和β4在乳腺发育各时期的表达

3.3 整联蛋白α6和β4奶牛乳腺发育不同时期蛋白表达量变化

3.4 奶牛乳腺上皮细胞的培养

3.4.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养结果

3.4.2 奶牛乳腺上皮细胞鉴定结果

3.4.3 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线

3.5 整联蛋白α6和β4在奶牛乳腺上皮细胞中的表达定位

3.6 奶牛乳腺上皮细胞中整联蛋白α6和β4 mRNA表达量变化

3.6.1 奶牛乳腺上皮细胞RNA提取鉴定结果

3.6.2 RT-PCR检测整联蛋白α6 mRNA表达量变化

3.6.3 RT-PCR检测整联蛋白β4 mRNA表达量变化

3.7 不同泌乳激素和生长因子对奶牛乳腺上皮细胞黏附的影响

3.8 不同泌乳激素和生长因子对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

3.8.1 血清与激素或生长因子联合处理对乳腺上皮细胞增殖能力影响

3.8.2 激素或生长因子单独处理对细胞增殖的影响

3.9 不同泌乳激素和生长因子以及整联蛋白α6和β4对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

3.9.1 乳糖含量的检测

3.9.2 乳脂含量的检测

3.9.3 乳蛋白含量的检测

4 讨论

4.1 乳腺中整联蛋白α6和β4的表达定位

4.2 乳腺中整联蛋白α6和β4的表达定量

4.3 泌乳期奶牛乳腺上皮细胞的培养

4.4 血清饥饿及细胞外基质对实验结果的影响

4.5 整联蛋白α6和β4对于细胞黏附的影响

4.6 整联蛋白及不同泌乳激素和生长因子对泌乳期乳腺上皮细胞增殖的作用

4.7 泌乳期乳腺上皮细胞中整联蛋白泌乳功能的影响

4.8 整联蛋白的研究展望

5 结论

致谢

参考文献

附录A

附录B

攻读学位期间发表的学术论文