L.casei EPS对小鼠派氏集合淋巴结CD4+T分化为Th17细胞及其分泌Th17趋化因子的影响

摘要

乳酸菌胞外多糖(lactic acid bacteria exopolysaccharides，LAB EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一种糖类化合物，具有抗肿瘤、增强免疫力、调节胃肠道功能等多种生物学活性，而且以其安全、无毒性，受到越来越多的青睐。目前国内对其免疫机制的研究并不深入。派氏集合淋巴结(peyer'patches，PP)被认为是肠黏膜免疫应答的启动位点，在肠道免疫耐受及防御感染方面起到关键作用，PP中含有各种各样的免疫细胞，由自身产生或由外界迁移而来，包括抗原递呈细胞，T、B淋巴细胞等，而Th17型T细胞是近几年新发现的效应型T细胞，由CD4+T细胞分化而来，主要分泌IL-17、IL-21等细胞因子，被认为是调控各种微生物感染的关键，且在Th17型应答在炎症性肠病中发挥主导作用。许多研究表明，在众多的乳酸菌多糖中，干酪乳杆菌胞外多糖(Lactobacillus casei exopolysaccharide，LcaseiEPS)具有较为突出的免疫调节特性，本研究主要探讨L.casei EPS对小鼠派氏集合淋巴结中CD4+T细胞的Th17方向的分化及其具体途径的影响，以及Th17细胞迁移至PP中的必要条件的影响，在这些方面阐明干酪乳杆菌胞外多糖的免疫调节机制。
　　 本研究主要包括以下内容：(1)将干酪乳杆菌的发酵液，经过三氯乙酸除蛋白、醇沉、透析等操作步骤，分离得到EPS。(2)用不同浓度的L.casei EPS溶液对6组BALB/c小鼠进行连续7天的灌胃饲养，处死后分离派氏集合淋巴结。(3)用ELISA方法分析小鼠派氏集合淋巴结中Th17分化成熟分泌的标志性因子IL-17、IL-21和IL-22的表达，并用流式细胞仪检测PP中Th17细胞数量，观察L.casei EPS对CD4+T细胞向Th17细胞分化程度的影响。(4)用ELISA方法分析小鼠PP中参与Th17细胞分化过程的重要细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-21、IL-23的表达，用western blot技术分析其分化过程中关键核转录因子RORγt的表达；用ELISA方法分析Th17分化过程的主要抑制因子IL-4、IFN-γ、IL-2的表达，观察L.casei EPS具体是以什么途径和方式影响Th17细胞的分化。(5)分别用ELISA方法和半定量PCR技术分析PP中Th17迁移所需的主要趋化因子CCL20的表达，观察L.casei EPS对其向PP中迁移的必要条件的影响。
　　 本研究主要得到以下结果：(1)L.casei EPS能够诱导小鼠派氏结集合淋巴结分泌Th17型细胞因子IL-17、IL-21和IL-22等，但同时也对这些因子的分泌起到了适当的控制作用，呈现出双向调控的免疫调节能力。(2)EPS能促进PP中Th17分化特异性转录因子RORγt的蛋白表达，说明EPS对Th17细胞的分化，是通过RORγt发挥作用的。(3)EPS能够刺激PP Th17分化过程中重要细胞因子TGF-β、IL-6、IL-23的分泌，说明多糖可通过诱导这些因子的分泌间接促进Th17细胞的分化。(4)在EPS作用下，Th17、Th1、Th2、Treg存在着既此消彼长相互制约，又相互促进的交叉性平衡调节。(5)EPS能够促进Th17迁移的必须趋化因子CCL20的蛋白表达及其mRNA的转录，而且这种促进作用具有保守性。由此可见，EPS能够通过调节PP分泌不同类型的细胞因子及趋化因子，诱导肠道PP启动Th17型免疫应答，同时也抑制了过度的Th17应答，控制自身免疫等机体损伤的发生，同时对Th17细胞的迁移创造了条件，可以预测在炎症小鼠肠道内，Th17细胞将由肠黏膜向PP中迁移发挥免疫调控作用。
　　 综上所述，本研究可以得出以下结论：干酪乳杆菌胞外多糖可诱导小鼠派氏结合淋巴结的CD4+T细胞的Th17型分化，并可抑制其过度分化，能够促进Th17细胞由肠黏膜向PP迁移。