三个新的鹅β-防御素的分离、鉴定及其抗菌机制的初探

摘要

全世界每年有数千人死于动物源病原微生物引起的传染病。其中，由于误食受细菌或病毒污染的禽肉、蛋产品为其主要原因。有些病原微生物，如沙门氏菌不仅能引起禽类的高死亡率，还能长期寄宿在家禽体内，进一步通过食物链威胁人类健康。近年来，由于欧盟及其他地区越来越多地国家禁止在畜禽饲料中使用促生长类抗生素，导致畜禽及其产品受病原微生物感染的机率更高。因此，开发新的免疫促进剂极为重要。机体的先天性免疫系统主要依赖于大量非特异的免疫分子，其中，抗菌肽由于其广泛杀菌作用而成为最具希望代替抗生素的新药制剂。禽p.防御素(Avian beta defensins，AvBDs)，为一类富含半胱氨酸的内源性抗菌肽，主要特点是含有由6个半胱氨酸残基组成的3对二硫键，为防御素的一个亚类。与其它动物抗菌肽类似，作为参与机体最初防御活动的小分子多肽，AvBDs在禽类的先天性免疫及获得性免疫中发挥重要作用。
　　 本实验应用RT-PCR方法，从鹅的脾脏、骨髓和法氏囊等组织器官中扩增到3个新的鹅AvBDs基因。将其推导的氨基酸序列与其它β-防御素序列分析比较，结果显示这三个AvBDs基因分别为鹅β-防御素1(AvBD1)、鹅β-防御素3(AvBD3)和鹅β-防御素6(AvBD6)。经核苷酸序列测定分析结果表明，鹅AvBD1是完整的开放阅读框(open reading frame，ORF)，其cDNA由198个碱基组成，编码65个氨基酸残基；鹅AvBD3并不是完整的ORF，其cDNA由182个碱基组成，编码60个氨基酸；鹅AvBD6是完整的ORF，其cDNA由204个碱基组成，编码67个氨基酸残基。将得到的鹅AvBD1、3、6基因推导的氨基酸序列与现已知的AvBDs序列及部分哺乳动物β-防御素序列，应用DNA Star软件中的ClustalⅤ方法进行序列比较，绘制分子遗传进化树。结果发现，鹅AvBD3和鹅AvBD6与对应的鸡AvBD3和鸡AvBD6基因的同源性为100％，鹅AvBD1与鸵鸟AvBD1基因的同源性最高，为70.7%。同时发现，这些基因与哺乳动物的β-防御素基因的同源性相对较低。
　　 将鹅AvBD1、3、6基因分别亚克隆到表达载pGEX-6p-1上，构建三个重组表达质粒pGEX-Goose-AvBD1、3、6将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG进行诱导表达，后进行蛋白纯化。SDS-PAGE电泳表明，3种重组蛋白分子量为31-32 ku，3个重组菌的表达产物均以包涵体的形式存在。同时，根据这3个多肽的成熟序列，分别合成3个合成多肽(sAvBD1、3、6)。选用4株革兰氏阳性菌(四联球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌)和8株革兰氏阴性菌(奇异变形杆菌、绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、兔波士杆菌)做为检测菌，利用菌落计数的方法测定标签蛋白GST、重组蛋白及合成蛋白鹅AvBD1、3、6的抗菌活性，并用SAS软件方差分析的方法进行分析结果。结果显示标签蛋白GST对各种细菌没有抑制作用；重组和合成蛋白对所测的12株细菌均具有不同程度的抑菌活性。本实验还以多杀性巴氏杆菌(G-)和金黄色葡萄球菌(G+)作为实验菌，测定不同盐浓度对重组蛋白以及合成蛋白的影响，结果显示，随着盐浓度的增加，其抗菌活性明显减弱，而在高盐浓度条件下，该重组蛋白仍具有抗菌活性。另外，对该重组、合成鹅AvBD1、3、6蛋白进行了溶血活性的试验，发现鹅AvBDs溶血活性极低，与阴性对照相比，无显著差异(P>0.05)。
　　 为探讨这三个鹅AvBDs的抗感染机制，本试验采用肠炎沙门氏菌人工感染15日龄东北籽鹅，分别于感染后6h、24 h、48 h、72 h采取鹅部分组织样品，主要是免疫组织和肠组织，并用荧光定量PCR方法检测这3个基因，部分炎性细胞因子，及其鹅Toll样受体(Toll-likereceptor，TLR)4的表达量。结果表明，受感染后，这3个AvBD基因在不同组织中的表达量变化较大，其中AvBD1基因在骨髓中的表达量显著提高，AvBD3基因在骨髓、脾和大肠中的表达量显著提高，AvBD6基因在免疫组织中的表达量都显著提高。以上结果说明了鹅AvBDs具有可诱导性。同时发现，TLR4，以及鹅白细胞介素(IL)-2，IL-18，γ干扰素(IFN-γ)基因的表达量也相应提高。本研究结果初步表明，受肠炎沙门氏菌感染后，鹅机体可能通过TLR4激活细胞信号转导途径，提供刺激分子，诱导由T细胞分化产生的两种鹅细胞因子(IL-2和IL-18)以及鹅干扰素基因(IFN-γ)和三种鹅AvBDs基因的表达，激活天然免疫反应，协同建立机体获得性免疫防御，共同抵御肠炎沙门氏菌对鹅机体的攻击。