黑穗醋栗叶片中黄酮类化合物的提取、分离纯化及生物活性的研究

摘要

黑穗醋栗(R.nigrum L.)俗称黑豆果，为黑龙江寒地特色小浆果，其叶片富含黄酮类化合物。本研究以黑穗醋栗叶片为对象，在研究其黄酮类化合物最佳提取工艺基础上，系统研究了黄酮类化合物分离纯化、鉴定及生物活性，以期为黑穗醋栗产业化生产提供支撑。
　　 在提取工艺中，采用响应面方法对超声波溶剂提取条件进行优化。确定最佳理论条件：超声时间30 min，超声功率517 W，液料比15.2:1 mL/g，此条件下理论预测黄酮提取量4.6916mg/g，实际操作条件：超声时间30 min，超声功率520 W，液料比15:1 mL/g。在此条件下黄酮提取量达4.5891 mg/g，与预测值4.6916 mg/g很接近。
　　 在纯化工艺中，采用大孔树脂为吸附材料进行纯化。通过静态试验比较六种大孔树脂对黑穗醋栗叶黄酮吸附与解吸效果，筛选出三种大孔树脂NKA-9、D4020、D101-1，并通过吸附与解吸动力学试验，确定NKA-9为黑穗醋栗叶黄酮纯化大孔树脂。通过NKA-9对黑穗醋栗叶黄酮动态吸附与解吸试验得到最佳条件；在25℃下，吸附流速1 mL/min(浓度为0.9311mg/mL)，吸附时间1h，进样量60 mL，洗脱剂为无水乙醇，洗脱流速1 mL/min，洗脱时间100 min，洗脱量100 mL。在此条件下黑穗醋栗叶片黄酮纯度可达40.15％，与纯化前(9.53％)比较，纯度提高4倍以上，可见NKA-9大孔树脂纯化效果很好。
　　 在分离工艺中，引入葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱对大孔树脂纯化后的黄酮进行分离。用无水甲醇溶液进行洗脱，洗脱流速为1.0 mL/min，通过HPLC检测(色谱条件为：色谱柱：Agilent-1100C18；流动相：甲醇：水(50:50)：流速：1.0 mL/min；检测器：Agilent-G1314A紫外检测器；检测波长；360 nm；温度：室温)，得到精黄酮。通过HPLC检测结果表明，黑穗醋栗叶中所含的黄酮类物质以芦丁为主，纯度为86.37％。
　　 在黄酮活性试验中，探讨了黄酮对蛋白质体外非酶糖基化的抑制作用，清除羟基自由基能力。结果表明，抑制作用随着黄酮浓度增加而增加；处理后第三天出现最大抑制率，61.89％。清除羟基自由基能力，随着黄酮浓度增加而增大，当黄酮浓度达到1.18 mg/mL，清除率达到65.4％，IC50为0.875 mg/mL。