黑豆花色苷提取、纯化及体内外抗氧化研究

摘要

我国黑豆资源十分丰富，东北地区和华北各地均有分布。黑豆含有的一些容易被体内所吸收营养物质，还可以促进其它营养物质的吸收、改善新陈代谢以及疾病预防和保健作用。现在随着消费者的关注，越来越多的研究者开始从植物中提取天然产物来代替人工合成的物质。花色苷就是存在植物中很好的一种天然产物，其化学性质稳定，着色力强、色泽鲜艳、价格低廉可以应用在食品、健品和生物制药领域，因此越来越为人们所接受。
　　 本试验以黑豆为原料，通过脱脂成为脱脂黑豆粉，在研究超声波辅助提取及纯化，并对纯化黑豆花色苷后进行体内生物活性研究。在提取工艺的研究中，首先脱脂溶剂的选择，以花色苷含量和总酚含量为指标，考察不同有机脱脂溶剂对黑豆花色苷的影响，确定石油醚为最好的脱脂溶剂，提取时以花色苷含量为指标，采用单因素验设计对超声波辅助提取法进行了试验条件的优化，实验表明最佳的提取条件:料液比1∶30，超声时间为30 min，超声温度50℃，超声功率280 W，此时花色苷质量分数1.42mg/g.
　　 在纯化工艺研究中，采用柱层析法，选择AB-8大孔树脂为柱填料，对黑豆花色苷的粗提液进行分离纯化，得到纯度较高的花色苷样品。通过单因素实验，确定AB-8纯化工艺条件的最佳条件为:AB-8大孔树脂以约为0.1 mg/mL的花色苷粗提液为上样液浓度，40min为吸附平衡时间，70min为解吸时间，吸附流速2.0mL/min，70％的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱流速2.0mL/min，此条件下实验数据表明，纯化后比纯化前花色苷质量分数提高约3倍。
　　 在黑豆花色苷的体内动物试验中，建立衰老模型小鼠，选取Ve作为对照，考察纯化后黑豆花色苷对衰老小鼠的保护作用。实验过程中，检测全血中的T-AOC和血清、肝脏和脑组织中SOD、GSH-Px、MDA活性和蛋白质羰基含量，试验结果:纯化后黑豆花色苷灌胃的小鼠与衰老模型组小鼠比较，体内T-AOC增加，SOD和GSH-Px活性升高，MDA和蛋白质羰基含量明显下降，并且黑豆花色苷的中剂量组与VE的结果相近，之间没有差异显著性，高剂量组优于VE组，表明黑豆花色苷提取物的抗衰老作用明显，是一种高效天然的抗氧化剂。
　　 在体外抗氧化实验研究中，进一步研究纯化后黑豆花色苷对DPPH和ABTS清楚自由基的能力、还原能力、清楚超氧阴离子的能力。并与同质量浓度VC进行对照实验表明，DPPH清除能力相接近，ABTS清楚自由基与还原能力略低于VC，但清楚超氧阴离子自由基的能力明显高于VC，证实了黑豆花色苷具有较强的抗氧化作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 黑豆的概述

1．1．1 黑豆的资源状况

1．1．2 黑豆的营养价值

1．2 花色苷类化合物的研究

1．2．1 花色苷的结构和化学性质

1．2．2 花色苷类化合物的提取、分离纯化方法

1．2．3 花色苷类化合物的生理功能

1．3 生物体的蛋白质损伤与自由基的关系

1．3．1 生物体内的自由基产生途径

1．3．2 自由基对蛋白质分子的损伤

1．3．3 蛋白质分子发生损伤的主要表现

1．3．4 自由基对其他生物分子引起的损伤

1．3．5 自由基损伤引起相关疾病及其防治

1．4 课题研究的意义及内容

1．4．1 课题研究的意义

1．4．2 课题研究的内容

2 试验材料与方法

2．1 材料与设备

2．1．1 主要原料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 工艺流程

2．2．2 黑豆花色苷提取的检测指标

2．2．3 黑豆花色苷的超声波辅助提取

2．2．4 黑豆花色苷的纯化

2．2．5 纯化后黑豆花色苷的体内作用研究

2．2．6 纯化后黑豆花色苷的体外作用研究

2．2．7 统计分析

3 结果与分析

3．1 各因素对黑豆花色苷提取的影响

3．1．1 溶剂脱脂处理对黑豆提取物中花色苷含量和总酚含量的影响

3．1．2 提取次数对黑豆中花色苷提取效果的影响

3．1．3 不同超声提取温度对黑豆提取物中花色苷提取效果的影响

3．1．4 不同提取料液比对黑豆提取物中花色苷提取效果的影响

3．1．5 不同超声功率对黑豆中花色苷提取效果的影响

3．2 各因素对AB-8大孔树脂纯化黑豆花色苷的影响

3．2．1 AB-8大孔树脂纯化黑豆花色苷的吸附平衡时间的确定

3．2．2 AB-8大孔树脂纯化黑豆花色苷的解吸平衡时间的确定

3．2．3 AB-8大孔树脂纯化黑豆花色苷的上样液浓度的确定

3．2．4 AB-8大孔树脂纯化黑豆花色苷的洗脱溶剂的确定

3．2．5 AB-8大孔树脂纯化黑豆花色苷的流速的确定

3．3．2 纯化前后黑豆花色苷含量的变化比较

3．4 纯化后黑豆花色苷对衰老模型小鼠的保护实验

3．3．1 D-半乳糖致衰老动物模型的建立

3．3．2 小鼠主要脏体比值

3．3．3 血清总抗氧化能力的影响

3．3．4 超氧化物歧化酶活性(SOD)

3．3．5 谷胱甘肽过氧化物酶活性(GSH-Px)

3．3．6 丙二醛含量(MDA)

3．3．7 蛋白质羰基含量

3．4 纯化后黑豆花色苷体外作用的影响

3．4．1 纯化后黑豆花色苷对DPPH清除率的影响

3．4．2 纯化后黑豆花色苷对ABTS清除能力的影响

3．4．3 纯化后黑豆花色苷对还原能力的影响

3．4．4 纯化后黑豆花色苷清楚超氧阴离子自由基的影响

4 讨论

4．1 超声波的作用对黑豆花色苷提取的探讨

4．2 AB-8大孔树脂分离纯化黑豆花色苷的优越性探讨

4．3 黑豆花色苷对体内抗氧化能力的探讨

4．4 黑豆花色苷体外抗氧化作用的探讨

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文