转录因子SigmaK和GerE对芽胞外壁组成基因的表达调控

摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)属于蜡样芽胞杆菌群(B.cereus group)，它是一种革兰氏阳性细菌。蜡样芽胞杆菌群在逆境环境中可以形成芽胞，成熟芽胞的最外层结构是芽胞外壁，除了蜡样芽胞杆菌群之外，在其它杆菌属如梭状芽胞杆菌的成熟芽胞中也存在芽胞外壁的结构。研究发现蜡样芽胞杆菌群芽胞外壁由基质和绒毛构成。基质有如一个帽子把芽胞包裹起来，丝状绒毛与基质紧密的连接在一起。目前对芽胞外壁的研究集中在芽胞外壁的组成成分、结构和功能，对芽胞外壁的组成蛋白受到哪些因子的转录调控鲜有报道。本文研究了芽胞形成晚期母细胞中的两个主要调控因子SigmaK和GerE对芽胞外壁组成蛋白的转录调控，为揭示芽胞外壁的形态发生机制和芽胞晚期母细胞中的调控网络奠定基础。
　　 根据报道的B.cereus和B.anthracis中的芽胞外壁相关蛋白序列，在B.thuringiensis subsp.kurstaki HD73菌株中发现了与其相似性较高的10个芽胞外壁蛋白。它们分别是芽胞外壁的绒毛蛋白BclA和BclB、芽胞外壁的基质结构蛋白ExsY和ExsB、芽胞外壁基质连接蛋白BxpB、芽胞外壁基质成分蛋白CotY、CotB-1和BxpA、以及芽胞外壁上的肌苷水解酶(IUNH)和超氧化物歧化酶(Sod)。构建了这10个基因启动子的lacZ融合表达载体——pHTbclAp、pHTbclBp、 pHTbxpBp、 pHTexsYp、pHTexsBp、pHTcotB-1p、pHTbxpAp、pHTcotYp、pHTsodp、pHTiunhp。将每个载体分别转化野生型菌株HD73，gerE基因缺失的突变株HD△gerE和sigK基因缺失的突变株HDAsigK。
　　 β-半乳糖苷酶活性分析表明，在sigK的突变体中，bxpB、exsB、exsY、bxpA、cotB-1、bclA、bclB和iunh基因启动子转录活性明显低于野生型HD73，说明这些基因的转录在芽胞形成晚期受SigmaK因子的控制。在gerE突变体中，bxpB、exsB、cotB-1、bclB和iunh基因启动子转录活性明显低于野生型HD73，说明这些基因的转录在芽胞形成晚期受GerE的正调控;而bxpA启动子活性与野生型相比反而升高了，说明bxpA基因的转录受到GerE的负调控。为了明确GerE蛋白对这些启动子是否为直接作用，表达纯化了该蛋白，利用DNA与蛋白质体外结合的凝胶阻滞方法发现GerE蛋白可以与bxpB、exsB、cotB-1、bxpA、bclB和iunh基因的启动子直接结合，说明这些基因受到GerE的直接调控。
　　 比较了受SigmaK因子控制的bxpB、exsB、bxpA、cotB-1、bclA和bclB在蜡样芽胞杆菌群菌株中启动区的SigmaK识别位点，发现这些基因启动区的SigmaK识别位点在这些菌株中十分保守。说明这些启动子在Bc群的这些菌株中可能均受到SigmaK的控制。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 蜡样芽胞杆菌群

1．2 芽胞的形态发生及其调控机制

1．2．1 芽胞期的选择

1．2．2 不对称隔膜的形成

1．2．3 芽胞的内吞

1．2．4 芽胞皮层的形成

1．2．5 芽胞衣的形成

1．3 芽胞外壁

1．3．1 芽胞外壁的结构

1．3．2 芽胞外壁的组成

1．3．3 芽胞外壁的组装

1．3．4 芽胞外壁的功能

1．4 立题依据

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 研究方法

2．2．1 PCR扩增目的基因

2．2．2 PCR扩增引物

2．2．3 酶切反应

2．2．4 DNA片段的连接

2．2．5 大肠杆菌热击感受态细胞的制备和转化

2．2．6 HD73菌株电击感受态细胞的制备与转化

2．2．7 β-半乳糖苷酶酶活分析

2．2．8 GerE蛋白的表达

2．2．9 GerE蛋白的纯化

2．2．10 GerE和启动子的凝胶阻滞实验

2．2．11 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

3 结果与分析

3．1 苏云金芽胞杆菌HD73芽胞外壁组成蛋白及其序列分析

3．1．1 芽胞外壁组成蛋白

3．1．2 10个芽胞外壁组成蛋白氨基酸序列分析

3．2 GerE和SigmaK对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞外壁基质基因的表达调控

3．2．1 SigmaK和GerE对芽胞外壁基质基因bxpB的表达调控

3．2．2 SigmaK和GerE对芽胞外壁基质基因exsB的表达调控

3．2．3 SigmaK对芽胞外壁基质基因exsY的表达调控

3．2．4 SigmaK和GerE对芽胞外壁基质基因bxpA的表达调控

3．2．5 SigmaK和GerE对芽胞外壁基质基因cotB-1的表达调控

3．2．6 GerE对芽胞外壁基质基因cotY的表达调控

3．3 GerE和SigmaK对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞外壁绒毛基因的表达调控

3．3．1 SigmaK对芽胞外壁绒毛基因bclA的表达调控

3．3．2 SigmaK和GerE对芽胞外壁绒毛基因bclB的表达调控

3．4 GerE和SigmaK对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞外壁酶基因的表达调控

3．4．1 SigmaK对芽胞外壁酶基因sod的表达调控

3．4．2 SigmaK和GerE对芽胞外壁酶基因iunh的表达调控

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文