大豆蚜热休克蛋白70基因的克隆、原核表达与定量分析

摘要

热休克蛋白Hsps(Heat shock proteins)是一类极度保守的应激蛋白，广泛地参与细胞的保护。目前，Hsp70家族被广泛认为是最为保守和重要的热休克蛋白家族。在胁迫环境下，如重金属、低氧、高温、饥饿、病原的入侵等的刺激下，Hsp70的表达量显著增加。热休克蛋白的高度表达能增强昆虫对外界胁迫因子的抵御能力，对昆虫机体维持细胞结构的完整性和正常新陈代谢有着非常重要的作用。通过分子生物学技术使害虫热休克蛋白的表达量降低，来减弱有害昆虫对外界不利环境的防御能力，从而达到协助杀灭害虫的目的。通过分子生物学技术使害虫热休克蛋白的表达量降低，来减弱有害昆虫对外界不利环境的防御能力，从而达到协助杀灭害虫的目的。
　　 大豆蚜(Aphis glycines Matsumura)属于半翅目(Hemiptera)、同翅类(Homoptera)、蚜科(Aphididae)、蚜属(Aphis)，是危害栽培大豆(Glycine max)最为主要的害虫之一，极大影响着大豆的品质和产量。目前，国内外尚未专门针对Hsp70蛋白对大豆蚜进行防治研究。本文通过RT-PCR及RACE技术克隆得到大豆蚜热休克蛋白70基因（Hsp70与Hsc70），成功构建表达载体，进行原核表达，获得大豆蚜Hsp70重组蛋白。并单头提取各温度热激条件下的大豆蚜RNA，进行实时荧光定量PCR分析。为今后研究大豆蚜在受到热胁迫后热休克蛋白70的表达规律及热控技术防治害虫提供依据。
　　 本研究以大豆蚜{Aphis glycines Matsumura)为材料，分别提取总RNA，利用RT-PCR和RACE技术，分别扩增得到大豆蚜的Hsp70基因与Hsc70基因的全长cDNA序列。并利用大肠杆菌pET21b表达系统对二者进行了原核表达，得到重组融合蛋白。
　　 本研究克隆了大豆蚜Hsc70 cDNA的全长的序列:这个序列含2281个碱基，其内部包含一个1965个碱基的开放阅读框，能够编码一个含654个氨基酸残基的蛋白，分子量大小为71.41kDa，等电点pI:5.22。大豆蚜Hsc70基因含两个典型的Hsp70家族的签名序列:1DLGTTYS（11～18残基）残基，IFDLGGGTFDVSIL（199～212残基）。推导的氨基酸序列中存在6个N位糖基化位点。利用SignalP4.0 Server软件分析后，结果表明:ORF核苷酸序列内的18～19位为信号肽切割位点。在GenBank上大豆蚜登录Hsc70的基因序列，获得登录号: KF052087。
　　 克隆了大豆蚜Hsp70 cDNA全长序列:这个序列含2268个碱基，其中包括一个1962个碱基的开放阅读框，能够编码一个含653个氨基酸残基的蛋白，分子量大小为71.22 kDa，等电点pI:5.43。大豆蚜Hsp70基因含三个Hsp70家族的签名序列:IDLGTTYS（10～17残基），IFDLGGGTFDVSIL（198～211残基），IVLVGGSTRIPK（335～349残基）。推导的氨基酸序列中存在6个N位糖基化位点。利用SignalP4.0 Server软件分析后，结果表明:ORF核苷酸序列内的17～18位为信号肽切割位点。在GenBank上大豆蚜登录Hsp70的基因序列，获得登录号:JQ340173。
　　 研究结果表明:大豆蚜Hsp70与Hsc70基因均含20种相同种类氨基酸，且各类氨基酸含量基本相同，均富含甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、赖氨酸Lys。昆虫热休克蛋白Hsp70作为一种糖蛋白，糖基化是酶活化的重要因素之一。利用NetOGlyc2.0软件发现在大豆蚜Hsp70氨基酸序列和Hsc70氨基酸序列中均有6个糖基化位点，除N-位糖基化位点以外，昆虫热休克蛋白Hsp70的氨基酸序列内含有很多硫酸化与磷酸化的位点，利用Expasy分子生物学服务器上的Prosite软件能够找到这些硫酸化与磷酸化位点，蛋白功能的发挥受到这些位点的调控。
　　 通过氨基酸序列一致性比较分析，可以明显的看出，大豆蚜Hsp70/Hsc70与其他昆虫Hsp70基因的氨基酸序列的相似度均在90％以上。
　　 分别重组大豆蚜Hsp70/Hsc70基因至pET21b载体内，在聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测后，都能够检测出目的融合蛋白。经Western blot分析后，结果表明:重组质粒pET/Hsp70的原核表达结果与预期结果相符，确为大豆蚜Hsp70基因的表达。
　　 利用Real time PGR技术，对不同温度胁迫下大豆蚜Hsp70与Hsc70表达水平进行相对定量分析表明:大豆蚜在25～37℃范围内，其Hsp70表达量随温度升高而上升，37℃时达到最高峰，为对照25℃时表达量的6.72倍，35～39℃，Hsp70表达量下降;大豆蚜在25～34℃范围内，其Hsc70表达量随温度升高变化不明显，34℃时表达量最高，但仅为对照25℃时表达最的1.79倍。由此可见高温胁迫能够诱导大豆蚜Hsp70的表达，但对Hsc70的表达影响不大，进一步说明Hsp70是在机体的一种应激蛋白，能够被高度诱导;Hsc70是一种组成型蛋白，外界环境刺激对其表达量影响不大。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 热休克蛋白的概述

1．1．1 热休克蛋白的分类

1．1．2 热休克蛋白在细胞内的分布及其分子结构的特征

1．1．3 热休克蛋白的特性

1．2 热休克蛋白Hsp70

1．2．1 热休克蛋白Hsp70家族的共有特性

1．2．3 热休克蛋白Hsp70和Hsc70的联系与区别

1．3 昆虫学中的Hsp70研究

1．3．1 Hsp70和昆虫滞育

1．3．2 Hsp70在昆虫生物学中的研究

1．4 研究目的及意义

1．5 试验技术路线

1．6 本试验课题的来源

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 昆虫的来源

2．1．2 试验仪器

2．1．3 分子生物学用的酶和试剂盒以及各种试剂和培养基

2．1．4 涉及生物信息学的相关的网站及软件

2．2 试验方法

2．2．1 大豆蚜RNA提取

2．2．2 利用RT-PCR扩增保守区之间的cDNA序列

2．2．3 RACE引物设计

2．2．4 3’-RACE的试验步骤

2．2．5 5’-RACE试验的步骤

2．2．6 全长cDNA的获取

2．3 序列分析

2．3．1 利用BLAST软件检索序列的相似性

2．3．2 分子的质量、碱基的分布、碱基的组成

2．3．3 全长cDNA可读框架的分析

2．3．4 分析ORF限制性酶切

2．3．5 核酸序列分析功能的预测

2．4 蛋白质基本性质的分析

2．5 蛋白质功能的预测

2．5．1 蛋白质序列同原性的分喜及蛋白质功能的测定

2．5．2 蛋白质的功能的预测

2．6 目的基因在原核载体内的表达

2．6．1 基因cDNA序列ORF PCR

2．6．2 pET21b质粒与PCR产物的酶切反应

2．6．3 表达载体(大肠杆菌)的建立

2．6．4 热休克蛋白Hsp70基因在大肠杆菌中诱导表达

2．6．5 SDS-PAGE电泳

2．7 表达蛋白的Western blot分析

2．7．1 表达蛋白的纯化

2．7．2 SDS-PAGE电泳

2．7．3 Western blot分析

2．8 大豆蚜Hsp70mRNA与Hsc70表达水平研究

2．8．1 大豆蚜基因的提取

2．8．2 荧光定量PCR引物的设计

2．8．3 荧光定量PCR的反应的相关体系和具体步骤

2．8．4 荧光定量PCR反应的结果分析

3 结果与分析

3．1 RT-PCR得到的基因保守区片段

3．1．1 大豆蚜Hsc70的基因保守区片段

3．1．2 大豆蚜Hsp70的基因保守区片段

3．2 Hsp70基因cDNA序列的3’RACE

3．2．1 大豆蚜Hsc70基因cDNA序列的3’RACE

3．2．2 大豆蚜Hsp70基因cDNA序列的3’-RACE

3．3 Hsp70基因cDNA序列的5’RACE

3．3．1 大豆蚜Hsc70基因cDNA序列的5’RACE

3．3．2 大豆蚜Hsp70基因cDNA序列的5’-RACE

3．4 Hsp70基因cDNA全长序列

3．4．1 大豆蚜Hsc70基因cDNA全长序列

3．4．2 大豆蚜Hsp70基因cDNA的全长序列

3．5 Hsp70基因全长cDNA序列推导的氨基酸序列分析

3．5．1 大豆蚜Hsc70基因全长cDNA序列推导的氨基酸序列分析

3．5．2 大豆蚜Hsp70基因全长cDNA序列推导的氨基酸序列分析

3．6 热休克蛋白70的基因特征分析

3．6．1 氨基酸序列组成的分析

3．6．2 信号肽分析

3．6．3 氨基酸糖集化位点的预测

3．6．4 氨基酸疏水性分析

3．6．5 蛋白三维结构模型预测

3．7 克隆获得的基因氨基酸的序列同源性的比较以及聚类分析

3．7．1 大豆蚜Hsc70基因氨基酸序列同源性的比较

3．7．2 大豆蚜Hsp70基因氨基酸序列同源性的比较

3．8 基因的氨基酸序列的聚类分析

3．8．1 大豆蚜Hsp70基因氨基酸序列同源性的比较

3．8．2 大豆蚜Hsc70基因氨基酸序列同源性比较

3．9 昆虫Hsp70在大肠杆菌中的表达

3．9．1 大肠杆菌重组表达载体pET21b／Hsp70的够建和鉴定

3．9．2 大豆蚜Hsp70蛋白表达及Western blot分析

3．10 Hsp70与Hsc70表达水平的研究

4 讨论

4．1 实验方法的探讨

4．1．1 基因克隆与原核表达过程中需要注意的问题

4．1．2 关于荧光定量分析的讨论

4．2 实验结果的探讨

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文