蛋氨酸、赖氨酸二肽对奶牛乳腺上皮细胞泌乳机能的影响

摘要

产奶量低和乳品质低一直是制约我国奶牛业发展的重要因素，加大泌乳调控机理研究对我国奶牛业发展具有重要的理论价值和应用价值。氨基酸是乳蛋白合成的重要底物，然而随着氨基酸营养研究的深入，许多学者们发现血液循环中的肽不仅参与乳腺细胞中氨基酸的合理供应和乳蛋白的合成，还弥补了乳腺组织对游离氨基酸摄入的不足。近年来有关小肽营养的研究主要侧重于日粮中添加小肽对奶牛生产性能影响，而关于小肽对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(DCMECs)泌乳机理及调控机制等方面的研究较少。SND1基因是重要的转录共激活子，而在DCMECs中的报道还较少。研究小肽营养与乳蛋白合成、乳腺泌乳能力的关系以及小肽与功能基因的互作关系将有助于揭示乳蛋白合成的调控机制。
　　 本试验成功构建体外培养的奶牛乳腺上皮细胞模型，添加不同浓度的蛋氨酸-蛋氨酸、赖氨酸-赖氨酸、蛋氨酸-赖氨酸以及赖氨酸-蛋氨酸二肽，应用CASY细胞活力分析仪检测体外培养的DCMECs的活力及增殖能力;运用实时荧光定量PCR检测四种二肽对β-酪蛋白mRNA表达水平的影响，确定四种二肽的最佳添加浓度，并进一步通过Western blot分析添加最佳浓度时泌乳相关蛋白的表达情况。应用免疫荧光细胞染色法检测SND1、PepT2、STAT5a和p-STAT5a在DCMECs内定位情况，对SND1进行基因沉寂和超表达，通过检测细胞的活力、增殖能力、mRNA表达以及蛋白表达确定其在泌乳信号通路中的作用。
　　 实验结果表明，培养24h时四种二肽的最佳添加浓度分别为80μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，80μg/ml。定位发现SND1在DCMECs的细胞核和胞质中都有分布，且主要在细胞核内表达，少量在胞质中存在;PepT2主要在细胞核周围分布，在细胞核内分布较少，细胞形态清晰可见;STAT5a和p-STAT5a在细胞核内及胞质中均有表达。SND1的干扰实验表明最佳的siRNA oligo浓度为25 nmol/mL; SND1干扰后三个基因mRNA表达均与阴性对照组差异显著，SND1干扰+MK组与SND1干扰组相比，SND1表达无显著差异，而STAT5a和β-casein表达差异显著;干扰SND1后，相关蛋白与对照组相比，差异显著(P＜0.05)，除PepT2与对照组无显著差异，添加MK后，蛋白的表达量并没有显著提高。SND1的超表达实验表明转染24h时细胞活力及增殖能力与未转染组相比差异显著(P＜0.05)，添加MK后细胞活力及增殖能力有所提高;SND1超表达后三个基因mRNA表达均与空载体组差异显著(P＜0.05);瞬时转染SND1后，泌乳相关蛋白与对照组相比，差异显著(P＜0.05);添加MK后，蛋白的表达量并没有显著提高。
　　 综上，小肽能促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关基因的表达及蛋白质合成，但效果并不理想;SND1能促进奶牛乳腺上皮细胞的活力及增殖能力，并调控乳蛋白基因表达及蛋白的合成。为深入研究奶牛泌乳调控机制提供了实验依据，为后续相关研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 乳蛋白合成机理及调控

1．1．1 乳蛋白组成及生物学作用

1．1．2 乳蛋白合成机理

1．1．3 乳蛋白合成营养调控

1．1．4 乳蛋白合成内分泌调控

1．2 奶牛的小肽营养

1．2．1 小肽营养概述

1．2．2 乳腺中小肽的吸收机制

1．2．3 小肽在乳蛋白合成中的作用

1．2．4 影响乳腺小肽利用的因素

1．3 乳蛋白合成信号转导通路

1．3．1 JAK2／STAT5途径

1．3．2 mTOR途径

1．4 SND1研究进展

1．4．1 SND1结构

1．4．2 SND1生物学功能

1．4．3 SND1在泌乳中的作用

1．5 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验试剂和仪器

2．1．1 实验试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 DCMECs的培养及鉴定

2．2．2 四种二肽作用DCMECs最佳作用浓度筛选

2．2．3 目的蛋白定位

2．2．4 SND1基因沉寂分析

2．2．5 SND1基因过表达分析

2．2．6 统计分析

3 结果与分析

3．1 奶牛乳腺上皮细胞培养及鉴定

3．2 二肽最佳作用浓度筛选

3．2．1 不同浓度蛋氨酸-蛋氨酸二肽对细胞活力、增殖及β-酪蛋白基因表达的影响

3．2．2 不同浓度赖氨酸-赖氨酸二肽对细胞活力、增殖及β-酪蛋白基因表达的影响

3．2．3 不同浓度蛋氨酸-赖氨酸二肽对细胞活力、增殖及β-酪蛋白基因表达的影响

3．2．4 不同浓度赖氨酸-蛋氨酸二肽对细胞活力、增殖及β-酪蛋白基因表达的影响

3．2．5 四种二肽对不同蛋白表达的影响

3．3 激光共聚焦定位分析

3．3．1 SND1细胞内定位

3．3．2 PepT2细胞内定位

3．3．3 STAT5a及p-STAT5a细胞内定位

3．4 SND1基因沉寂分析

3．4．1 SND1沉寂效率

3．4．2 siRNA干扰对细胞活力及增殖能力影响

3．4．3 siRNA干扰对SND1、STAT5、β-酪蛋白mRNA基因表达的影响

3．4．4 siRNA干扰对泌乳相关蛋白表达的影响

3．5 SND1基因过表达分析

3．5．1 SND1基因PCR扩增结果

3．5．2 重组质粒pGCMV／IRES／EGFP／SND1验证

3．5．3 SND1过表达效率检测

3．5．4 SND1过表达对DCMECs细胞活力及增殖的影响

3．5．5 SND1过表达对DCMECs SND1、STAT5a、β-酪蛋白mRNA基因表达的影响

3．5．6 SND1过表达对DCMECs对泌乳相关蛋白表达的影响

4 讨论

4．1 奶牛乳腺上皮细胞培养、纯化与鉴定分析

4．2 二肽对奶牛乳腺上皮细胞的作用

4．3 目的蛋白细胞内定位分析

4．4 SND1基因沉寂对乳腺上皮细胞泌乳影响

4．5 SND1过表达对乳腺上皮细胞泌乳影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文