葡萄糖酸铬对3T3-L1细胞增殖分化与凋亡的影响

摘要

三价铬作为葡萄糖耐量因子(Glucose tolerance factor, GTF)的组分，是机体必需的微量元素，它与碳水化合物、脂肪和蛋白质等物质的代谢相关。它的缺乏影响碳水化合物代谢，引起高血糖、高血脂等症状，而补充三价铬可以缓解这些病症。它通过促进脂肪的消耗进而降低机体体脂含量，从细胞生物学角度说，它抑制肥胖的途径主要是影响前体脂肪细胞增殖，促进前体脂肪细胞凋亡，抑制前体脂肪细胞分化，减少胞内脂肪合成，增加脂解等。成熟的脂肪细胞属于终末期分化细胞，没有增殖分化能力，所以脂肪细胞增殖分化的研究很难在体内进行。来源于3T3细胞克隆分离得到的3T3-L1细胞系，能连续传代，它从有丝分裂汇合到接触性抑制和克隆性增生的过程，细胞状态经历了前体脂肪细胞到成熟脂肪细胞的转变，因此对体内脂肪细胞增殖分化的研究多采用3T3-L1细胞作为研究模型。
　　 本课题主要研究葡萄糖酸铬(Chromium Gluconate，CrGlu)和吡啶羧酸铬(ChromiumPicolinate，CrPic)对3T3-L1细胞增殖分化的影响，采用WST-1法观察细胞生长抑制并确定半数抑制浓度(IC50)，LDH(Lactate dehydrogenase)法评价CrGlu和CrPic引起的细胞膜损伤，Hoechst染色法观察凋亡细胞的形态学特征，流式细胞计法测定细胞凋亡，并且测定了不同浓度的三价铬对3T3-L1脂肪细胞内脂质(TG)沉积效率的影响，同时也对相关基因进行了初步研究。通过以上实验方法比较不同配体的三价铬生理活性差异，为其应用提供理论支持。
　　 通过本课题得到了以下结果:
　　 1.在CrGlu浓度为50～200μmol/L，处理时间为24～72 h范围内，可以明显抑制3T3-L1脂肪细胞的增殖，抑制效果随CrGlu浓度和处理时间增强，并可诱导细胞产生凋亡;同时还发现200μmol/L CrGlu和CrPic相比，具有更高的抑制3T3-L1脂肪细胞增殖的活性。
　　 2.100～200μmol/L CrGlu可以显著抑制3T3-L1脂肪细胞分化，并且减少细胞内TG的积聚，能够促进细胞内TG的降解，并且随着CrGlu浓度的提高，其生理活性越强;低浓度(10～50μmol/L) CrGlu对3T3-L1脂肪细胞分化无明显影响。同时还发现200μmol/L CrGlu和CrPic相比，具有更高的抑制3T3-L1脂肪细胞分化的活性。
　　 3.三价铬能够抑制PPARγ、C/EBPα的活性，同时下调PPARγ、C/EBPα和蛋白表达，高浓度三价铬抑制作用更强烈;且200μmol/L CrGlu和CrPic相比，对这种抑制和下调作用作用更强。研究还发现低浓度(10～50μmol/L)CrGlu对PPARγ、C/EBPα表达量无明显影响(P＜0.05)。
　　 本课题可初步得到以下结论:三价铬对3T3-L1脂肪细胞增殖有抑制作用，并可诱导细胞产生凋亡。研究还证实高浓度CrGlu(100～200μmol/L)能够抑制脂肪细胞的分化，减少细胞内TG的积聚，同一浓度(200μmol/L)下，CrGlu与CrPic相比具有更高的抑制细胞内TG积累的效率。进一步的探讨表明在此过程中，能够明显抑制PPARγ、C/EBPα的表达。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 脂肪细胞的分化及其分子调控机制

1．1．1 关于脂肪细胞的起源和分化过程

1．1．2 发生在脂肪细胞分化过程中的形态学变化

1．1．3 脂肪细胞分化过程中的分子标志

1．2 脂肪细胞凋亡的研究进展

1．2．1 细胞凋亡概述

1．2．2 细胞凋亡的生物学特征

1．2．3 脂肪细胞凋亡的分子机制

1．2．4 细胞凋亡的检测方法

1．2．5 脂肪细胞凋亡与肥胖

1．3 葡萄糖酸铬在脂肪细胞作用中的研究进展

1．3．1 三价铬的生理功能

1．3．2 三价铬对脂肪细胞作用的研究概况

1．4 展望

1．5 研究意义与目的

1．5．1 立题意义

1．5．2 研究目的

1．6 课题的研究内容

1．6．1 葡萄糖酸铬对3T3-L1细胞增殖的影响

1．6．2 葡萄糖酸铬诱导3T3-L1细胞凋亡的作用

1．6．3 葡萄糖酸铬对3T3-L1细胞分化的影响

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 试剂

2．1．3 主要仪器设备和实验用液

2．2 实验方法

2．2．1 原子吸收测定铬含量

2．2．2 WST-1法检测细胞存活率

2．2．3 乳酸脱氢酶释放量检测

2．2．4 Hoechst染色法观察细胞凋亡

2．2．5 流式测定细胞凋亡

2．2．6 葡萄糖酸铬对3T3-L1细胞分化的影响

2．2．7 RT-PCR检测PPARγ和C／EBPα mRNA的表达量

2．2．8 葡萄糖酸铬对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响

2．2．9 数据处理及统计分析

3 结果与分析

3．1 原子吸收测定铬含量

3．2 WST-1法检测葡萄糖酸铬对3T3-L1细胞增殖的抑制

3．3 3T3-L1细胞的LDH释放量检测

3．4 Hoechst染色法观察细胞凋亡

3．5 流式测定细胞凋亡

3．6 葡萄糖酸铬对3T3-L1细胞分化的影响

3．6．1 3T3-L1脂肪细胞Oil Red O染色

3．6．2 Oil Red O染色提取法检测前体脂肪细胞分化

3．6．3 3T3-L1脂肪细胞TG含量检测

3．6．4 葡萄糖酸铬对3T3-L1脂肪细胞PPARγ和C／EBPα表达的影响

3．7 葡萄糖酸铬对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响

4 讨论

4．1 葡萄糖酸铬的生理活性

4．2 葡萄糖酸铬对3T3-L1脂肪细胞的增殖抑制作用

4．3 葡萄糖酸铬对3T3-L1脂肪细胞分化的影响

4．4 展望

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文