猪PRRSV HH08株单克隆抗体制备及抗原捕捉ELISA方法建立

摘要

猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。该病通过多种途径传播，建立一种快速高效的ELISA检测方法，对PRRSV检测、免疫学研究具有重要意义和应用价值。
　　 将浓缩纯化的PRRSV HH08株免疫BALB/c小鼠，每隔2周免疫一次，待血清抗体效价达到1∶10000以上，加强免疫后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。经间接ELISA筛选，有限稀释法克隆，获得了5株稳定分泌抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为A7、B4、B8、B12和G12，并对A7、B4、B8和B12四株杂交瘤株制备了腹水。辛酸-饱和硫酸铵法纯化A7和B8腹水，SDS-PAGE分析可见单一且清晰的分子量约55 kDa重链和25 kDa轻链，纯化效果好。ELISA检测显示，细胞上清和腹水抗体效价分别在1∶256～1∶2048和1∶6400～1∶51200，腹水抗体效价明显高于细胞上清。Western blot结果显示所有单克隆抗体均与PRRSV在蛋白分子量97.2～66.4 kDa间出现特异性反应条带，IFA鉴定表明单抗能够识别到病毒而出现特异性荧光。Ig亚类鉴定A7、B8和B12属于IgG2b，B4和G12属于IgM。杂交瘤细胞染色体计数平均数量在84～100条，均多于SP2/0细胞的66条染色体。特异性试验证明这5株单抗仅与PRRSV发生特异性反应。
　　 以PRRSV免疫兔制备兔抗PRRSV多克隆抗体，并用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化IgG。以纯化的多克隆抗体作为包被抗体，单克隆抗体B8作为检测抗体，建立抗原捕捉ELISA方法。该方法的最佳反应条件为:兔抗PRRSV多抗包被浓度为40μg/mL，鼠抗PRRSV单抗B8工作浓度为1.25μg/mL，待检样品孵育时间90 min，酶标二抗工作浓度为1∶5000，实验确定OD490nm＞0.175为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数均小于10％，最低检出量为1735 TCID50/0.1 mL，可用于检测PRRSV经典株和变异株，与Mrac-145细胞及其他参考猪病病原无交叉反应。采用建立的抗原捕捉ELISA方法检测11份临床感染病料样品，与RT-PCR比较，两者具有很高的符合率。结果表明，建立的抗原捕捉ELISA方法具有较好的特异性和敏感性，可用于PRRSV的快速检测。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 PRRSV病原学

1．1．1 PRRSV基因组结构

1．1．2 PRRSV非结构蛋白

1．1．3 PRRSV结构蛋白

1．2 PRRS流行病学

1．3 PRRS致病机理

1．4 PRRS临床症状和病理变化

1．4．1 临床症状

1．4．2 病理变化

1．5 PRRS诊断技术

1．5．1 临床诊断

1．5．2 组织病理学检查

1．5．3 病毒分离

1．5．4 分子生物学诊断方法

1．5．5 血清学诊断方法

1．6 PRRSV单克隆抗体研究进展

1．6．1 单克隆抗体概述

1．6．2 抗PRRSV单克隆抗体研究进展

1．7 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物及细胞

2．1．2 病毒

2．1．3 培养基和主要试剂

2．1．4 主要试剂的配制

2．1．5 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 抗原制备

2．2．2 BALB／c小鼠免疫程序

2．2．3 间接ELISA方法建立

2．2．4 杂交瘤细胞株建立与筛选

2．2．5 单克隆抗体制备

2．2．6 单克隆抗体生物学特性鉴定

2．2．7 兔抗PRRSV多克隆抗体制备与纯化

2．2．8 抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)优化

2．2．9 抗原捕捉ELISA方法灵敏性试验

2．2．10 抗原捕捉ELISA方法特异性试验

2．2．11 抗原捕捉ELISA方法重复性试验

2．2．12 抗原捕捉ELISA方法与RT-PCR方法检测临床样品

2．2．13 数据统计

3 结果

3．1 抗原制备

3．1．1 病毒增殖及TCID50测定

3．1．2 病毒浓缩纯化

3．2 单克隆抗体制备

3．2．1 间接ELISA方法建立

3．2．2 杂交瘤细胞株建立与筛选

3．2．3 腹水制备与纯化

3．3 单克隆抗体生物学特性鉴定

3．3．1 单克隆抗体效价与浓度测定

3．3．2 单克隆抗体Western blot鉴定

3．3．3 单克隆抗体杂交瘤细胞稳定性

3．3．4 杂交瘤细胞染色体计数

3．3．5 单克隆抗体Ig亚类鉴定

3．3．6 单克隆抗体特异性分析

3．3．7 免疫荧光试验

3．4 PRRSV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法建立与应用

3．4．1 免抗PRRSV多克隆抗体制备与纯化

3．4．2 抗原捕捉ELISA优化

3．4．3 抗原捕捉ELISA方法灵敏性试验

3．4．4 抗原捕捉ELISA方法特异性试验

3．4．5 抗原捕捉ELISA方法重复性试验

3．4．6 抗原捕捉ELISA方法与RT-PCR方法检测临床样品

4 讨论

4．1 病毒浓缩纯化

4．2 杂交瘤细胞株建立及筛选

4．3 腹水制备及纯化

4．4 单克隆抗体生物学特性鉴定

4．5 抗原捕捉ELISA检测方法建立

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文