基于内部核糖体进入位点提高重组NDV表达vvIBDV VP2基因的研究

摘要

随着反向遗传操作技术的成熟，利用新城疫病毒(NDV)作为病毒活载体研制多价疫苗已进入成熟阶段。目前已有将IBDV免疫保护性抗原VP2蛋白的基因、IBV免疫保护性抗原S蛋白的基因及H5亚型禽流感病毒的HA基因分别插入到新城疫病毒，进行重组新城疫病毒活载体二联苗的研究。以病毒为表达载体研制的大多数基因工程疫苗存在外源病原的免疫保护性基因的表达量低这一问题，因而达不到预期的免疫效果。以NDV为活载体的基因工程疫苗也不例外，外源免疫保护性基因插入NDV适宜位点后表达量较低，限制了重组NDV疫苗的效果和使用，因此如何提高外源基因表达量成为该类疫苗研发的瓶颈问题。
　　 VP2蛋白是IBDV的主要结构性蛋白，具有良好的抗原性，在宿主体内可诱导产生中和抗体，因此VP2基因是研究IBDV疫苗的重要目的基因。为了提高重组NDV外源基因表达量，本研究采用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV) HLJ07株VP2双拷贝基因的重组NDV(rClone30-VP2-IRES-VP2)，同时构建表达单拷贝VP2基因的重组NDV(rClone30-VP2)作为对照。利用PCR方法分别将HpaⅠ、BamHⅠ和SacⅡ引入VP2基因的5'端和3'端;将BamHⅠ、EcoRⅠ、MluⅠ和SacⅡ引入IRES基因的5'端和3'端;EcoRⅠ、BamHⅠ和MluⅠ引入第二个VP2基因的5'端和3'端。将其分别克隆至pMD18-T。依次通过BamHⅠ和SacⅡ将IRES基因克隆至VP2基因的3'端，通过EcoRⅠ和MluⅠ将第二个VP2基因克隆至IRES基因的3'端，构建重组质粒pMD-VP2-IRES-VP2。将VP2-IRES-VP2片段插入pClone30的MCS位点中，构建带有VP2-IRES-VP2基因片段的NDV全长cDNA，并将携带全长cDNA的转录质粒命名为pClone30-VP2-IRES-VP2。构建的pClone30-VP2-IRES-VP2质粒经BamHⅠ酶切除去IRES-VP2，将酶切后的片段自连得到pClone30-VP2。将两种转录质粒分别与表达核衣壳蛋白、磷酸化蛋白和大聚合酶蛋白的辅助质粒共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，拯救获得的重组病毒通过鸡胚进行增殖并收集尿囊液，重组病毒分别命名为新城疫rClone30-VP2-IRES-VP2株和rClone30-VP2株。
　　 在鸡胚成纤维细胞中进行的重组病毒增殖实验表明，VP2基因和VP2-IRES-VP2基因片段的插入并未对病毒在细胞内的增殖能力造成影响。间接免疫荧光试验(IFA)表明VP2蛋白在感染两种重组病毒的鸡胚成纤维细胞(DF-1)中均有表达。Real-time PCR检测结果表明rClone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2对照组。重组NDV以0.00001MOI感染HepG2细胞时，rClone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA的相对表达量是rClone30-VP2的1.6倍。
　　 综上所述，本研究通过建立NDV的反向遗传操作系统构建了表达IBDV双拷贝VP2基因的重组NDV，并证明重组病毒中双拷贝基因的表达水平优于单拷贝基因，提高了外源基因的表达水平，为提高重组NDV等基因工程疫苗的外源基因表达量提供了新的思路，为研制NDV-IBDV二价活载体疫苗奠定基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 新城疫病毒(NDV)

1．1．1 NDV简介

1．1．2 NDV的形态学特征

1．1．3 NDV的基因组结构

1．2 反向遗传操作技术

1．3 NDV活载体疫苗的简介

1．4 IBDV简介

1．4．1 IBD简介

1．4．2 IBDV的形态及基因组结构

1．4．3 IBDV的主要保护性抗原

1．4．4 IBDV的免疫防治

1．5 内部核糖体进入位点

1．6 本研究的目的与意义

2 材料

2．1 病毒株、细胞株和质粒

2．2 培养基及生化试剂

2．3 引物

2．4 鸡胚

2．5 主要仪器和设备

3 方法

3．1 vvIBDV VP2基因克隆与序列分析

3．1．1 vvIBDV VP2基因的PCR扩增

3．1．2 PCR产物的纯化

3．1．3 vvIBDV VP2基因克隆序列测定

3．2 IRES基因克隆及序列分析

3．2．1 IRES基因的PCR扩增

3．2．2 PCR产物的纯化

3．2．3 IRES基因克隆的序列测定

3．3 VP2(BamH I)基因克隆与序列分析

3．3．1 VP2(BamH I)基因的PCR扩增

3．3．2 PCR产物的纯化

3．3．3 VP2(BamH I)基因克隆的序列测

3．4 pMD-VP2-IRES-VP2(BamH I)质粒的构建

3．4．1 pMD-VP2-IRES质粒的构建

3．4．2 pMD-VP2-IRES-VP2(BamH I)质粒的构建

3．5 表达VP2-IRES-VP2(BamH I)重组病毒基因组全长cDNA的构建

3．5．1 VP2-IRES-VP2(BamH I)基因片段与重组NDV病毒基因组转录载体片段的制备

3．5．2 VP2-IRES-VP2(BamH I)基因片段与重组NDV病毒基因组转录载体片段连接

3．5．3 重组质粒的鉴定

3．6 表达vvIBDV VP2基因重组病毒基因组全长cDNA的构建

3．6．1 rClone30-VP2片段的制备

3．6．2 rClone30-VP2片段连接

3．6．3 重组质粒的鉴定

3．7 重组NDV的拯救及鉴定

3．7．1 重组NDV的拯救

3．7．2 重组NDV的RT-PCR鉴定

3．7．3 拯救后的重组NDV TCID50测定

3．7．4 重组NDV的细胞增殖稳定性

3．7．5 间接免疫荧光检测(IFA)重组病毒VP2基因的表达

3．7．6 重组病毒VP2基因的mRNA水平的检测

4 实验结果

4．1 vvIBDV VP2基因克隆

4．1．1 vvIBDV VP2基因的PCR扩增

4．1．2 PCR产物的纯化

4．1．3 VP2基因的序列测定

4．2 IRES基因克隆

4．2．1 IRES基因的PCR扩增

4．2．2 PCR产物纯化

4．2．3 IRES基因的序列测定

4．3 VP2(BamH I)基因克隆

4．3．1 VP2(BamH I)基因的PCR扩增

4．3．2 PCR产物纯化

4．3．3 VP2(BamH I)基因的序列测定

4．4 pMD-VP2-IRES质粒的构建及阳性重组质粒的鉴定

4．4．1 IRES基因片段和pMD-VP2载体片段的制备

4．4．2 阳性重组质粒的鉴定

4．5 pMD-VP2-IRES-VP2重组质粒的构建和阳性重组质粒的鉴定

4．5．1 VP2(BamH I)基因片段和pMD-VP2-IRES载体片段的制备

4．5．2 阳性重组质粒的鉴定

4．6 重组NDV rClone30-VP2-IRES-VP2基因组载体的构建和阳性重组质粒的鉴定

4．6．1 VP2-IRES-VP2基因片段和rClone30载体片段的制备

4．6．2 阳性重组质粒的鉴定

4．7 重组NDV rClone30-VP2基因组载体的构建和阳性重组质粒的鉴定

4．7．1 rClone30-VP2载体片段的制备

4．7．2 阳性重组质粒的鉴定

4．8 重组NDV的拯救及鉴定

4．8．1 重组NDV的拯救

4．8．2 重组NDV RT-PCR鉴定

4．9 重组NDV细胞增殖稳定性检测

4．10 IFA鉴定重组病毒VP2的表达

4．11 重组病毒VP2基因mRNA水平检测

5 讨论

5．1 vvIBDV VP2基因的选择

5．2 内部核糖体进入位点的选择

5．3 外源基因的插入位置的选择

5．4 重组NDV的构建及拯救

5．5 重组病毒的增殖能力

5．6 重组病毒VP2基因表达量的比较

6 结论

致谢

参考文献

附录A

附录B

攻读硕士学位期间发表的学术论文