猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白单克隆抗体的制备与抗原表位的鉴定

摘要

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)感染引起传染病，能够引起仔猪典型胃肠道症状甚至死亡。TGEV基因组为不分段的单股正链RNA，共编码四种结构蛋白。目前，对TGEV的纤突糖蛋白S抗原表位的研究非常深入，但是针对膜糖蛋白M抗原表位仍有待深入研究。
　　 本研究首先通过聚合酶链式反应扩增了去除信号肽的M基因，并将其插入原核表达载体pGEX-6p-1。通过优化蛋白诱导表达的条件，使pGEX-M在“37℃、IPTG终浓度0.5 mM、诱导6h”的条件下，在宿主菌Rossetta中成功表达了重组TGEV M蛋白。纯化的重组TGEV M蛋白为制备抗M蛋白单克隆抗体提供了确实的实验材料。
　　 同时，以超速离心得到的TGEV颗粒为免疫原、按照经典的单克隆抗体制备方法，成功制备了一株能够产生抗TGEV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为7G7。间接免疫荧光结果证明，抗M蛋白单克隆抗体可以识别天然状态下的TGEV颗粒;Western blot结果证明，7G7上清也可以与变性条件下的重组M蛋白发生反应;对单克隆抗体针对的抗原位点进行初步分析，间接ELISA结果表明，抗原位点位于病毒囊膜外侧;对单克隆抗体特异性分析，结果显示，7G7上清仅与TGEV发生反应、并不识别其它猪源病毒。以上结果证明，抗M单克隆抗体可以作为M蛋白抗原位点筛选的良好靶分子。
　　 随后以纯化的腹水为靶分子，通过4轮优化的噬菌体筛选步骤，最后随机挑取10个噬菌体蓝斑进行扩增、滴度测定，并检测它们与靶分子的亲和能力。亲和能力检测结果显示，10个随机噬菌体与靶分子之间都具备高度亲和能力。对源于10个随机噬菌体的靶向序列进行测序，结果显示，10个随机噬菌体均携带相同的外源12肽“VHIDPHHQHDQM”，并命名为phage-V。将外源12肽与M蛋白进行序列比对，发现12肽与M蛋白第197至210位氨基酸具有一定的相似性，其中有三个相近位点的氨基酸完全一致（第199位I、第200位D和第203位P）。最终，竞争性阻断的结果表明，phage-V对TGEV或重组M蛋白与单抗的结合起阻断作用，而且这种阻断效果与phage-V的投入量呈正相关。综合以上结果可以证明，通过噬菌体展示技术筛选出的12肽VHIDPHHQHDQM，既可以直接与抗M蛋白单克隆抗体结合，又可以竞争性地阻断病毒或M蛋白与抗体之间的结合，说明该12肽模拟了M蛋白抗原表位;由于12肽中仅3个临近氨基酸与M蛋白完全一致，推测该12肽可能是M蛋白抗原表位的空间构象，而这3个氨基酸所组成的基序可能发挥重要的免疫学作用。
　　 本实验将单克隆抗体制备及噬菌体展示技术联合应用，成功筛选出TGEV M蛋白的空间构象型表位，为TGEVM蛋白抗原表位研究填补了空白，并为基于表位的诊断方法建立和抗原表位型疫苗的开发提供了参考。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 猪传染性胃肠炎(TGE)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)概述

1．1．1 TGE的流行病学特征

1．1．2 TGEV的病原学特征

1．1．3 TGEV的基因组特征

1．1．4 TGEV的结构蛋白及其生物学功能

1．2 抗原表位的研究方法

1．2．1 抗原表位的概述

1．2．2 T细胞抗原表位的研究手段

1．2．3 B细胞抗原表位的研究手段

1．2．4 表位疫苗的研究进展

1．3 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与载体

2．1．2 细胞与病毒

2．1．3 实验动物

2．1．4 主要试剂

2．1．5 标准参照物

2．1．6 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 TGEV-M基因亚克隆及原核表达

2．2．2 TGEV M蛋白单克隆抗体制备及特性鉴定

2．2．3 应用噬菌体展示技术筛选TGEV M蛋白抗原表位

3 结果与分析

3．1 TGEV M基因亚克隆及原核表达

3．1．1 重组表达质粒pGEX-M的构建与鉴定

3．1．2 TGEV M蛋白的原核表达、纯化

3．2 TGEV M蛋白单克隆抗体制备及特性鉴定

3．2．1 融合前抗M蛋白抗体效价测定

3．2．2 阳性杂交瘤细胞的筛选

3．2．3 单克隆抗体亚类鉴定

3．2．4 间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体与TGEV的结合情况

3．2．5 免疫印迹方法鉴定单克隆抗体与M蛋白的结合情况

3．2．6 7G7上清针对病毒囊膜内外抗原识别位点的初步鉴定

3．2．7 单克隆抗体特异性分析

3．2．8 腹水制备与纯化

3．3 TGEV M蛋白抗原表位的筛选

3．3．1 噬菌体筛选与扩增

3．3．2 亲和能力检测与测序

3．3．3 竞争性阻断实验

4 讨论

4．1 TGEV M蛋白原核表达

4．2 TGEV M单克隆抗体制备及特性鉴定

4．2．1 TGEV颗粒作为免疫原的优越性

4．2．2 抗M蛋白单克隆抗体7G7特性分析

4．2．3 单克隆抗体腹水制备与纯化

4．2．4 通过噬菌体展示技术筛选TGEV M蛋白抗原表位

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文