产气荚膜梭菌与化脓隐秘杆菌二联灭活疫苗的制备及体液免疫效果评价

摘要

产气荚膜梭菌病又称为“猝死症”，近年来，我国许多牛场爆发产气荚膜梭菌病，其一年四季均可发病，以夏秋两季高发。该病呈全球流行态势，目前主要利用抗生素和灭活疫苗对该病进行控制，化脓隐秘杆菌感染常引起家畜多器官的化脓性感染，主要表现为肺炎、乳房炎、皮下脓肿等，由于有效疫苗的缺乏，目前对其控制主要是抗菌药物。
　　 为有效控制A型产气荚膜梭菌和化脓隐秘杆菌病的发生与流行，本研究分别以牛源A型产气荚膜梭菌C987强毒株和病牛体内分离到的化脓隐秘杆菌菌株为基础，建立其病理感染模型，比较了铝胶佐剂、蜂胶佐剂、壳聚糖佐剂对疫苗免疫效果的影响，成功研制了不同菌悬液配比的二联灭活疫苗，并对其免疫效果进行评价。
　　 用建立的ELISA方法检测其特异性抗体，两种细菌性疫苗均显示铝胶佐剂对诱导小鼠机体产生特异性免疫应答能力强于蜂胶佐剂组和壳聚糖佐剂组，免疫攻毒保护试验结果也证实，两种细菌的铝胶佐剂疫苗对小鼠的免疫保护率都高于其他佐剂疫苗组，但其中化脓隐秘杆菌铝佐剂疫苗不能对小鼠提供100％的保护。因此通过把两种抗原进行不同比例配比，来增强化脓隐秘杆菌疫苗的免疫效果。结果显示:1∶4混合比例疫苗组PLO蛋白特异性抗体水平较1∶1、1∶2混合比例疫苗组高，但无显著差异(P＞0.05)，腹腔接种2LD50化脓隐秘杆菌菌量，1∶4疫苗组可以给小鼠提供100％保护力;1∶4混合比例疫苗组α毒素蛋白特异性抗体水平略低于1∶1、1∶2混合比例疫苗组，但差异不显著(P＞0.05)。皮下接种2LD50产气荚膜梭菌菌量，1∶1、1∶4疫苗组均可给小鼠提供100％保护力。综合以上考虑，最终产气荚膜梭菌及化脓隐秘杆菌二联灭活疫苗的最适抗原混合比例为1∶4，免疫佐剂为铝胶佐剂。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 产气荚膜梭菌病概述

1．1．1 产气荚膜梭茵

1．1．2 产气荚膜梭菌病及临床症状

1．1．3 产气荚膜梭菌病的防治

1．2 化脓隐秘杆菌病概述

1．2．1 化脓隐秘杆菌

1．2．2 化脓隐秘杆菌病及临床症状

1．2．3 化脓隐秘杆菌病的防治

1．3 多联灭活疫苗的研究进展

1．4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 质粒、血清、菌株

2．1．3 主要试剂及抗体

2．1．4 主要仪器

2．2 A型产气荚膜梭菌及化脓隐秘杆菌小鼠感染模型的建立

2．2．1 A型产气荚膜梭菌小鼠感染模型的建立

2．2．2 化脓隐秘杆菌小鼠感染模型的建立

2．3 α毒素蛋白及PLO蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

2．3．1 α毒素蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

2．3．2 PLO蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

2．4 产气荚膜梭菌和化脓隐秘杆菌灭活条件的优化及免疫佐剂的选择

2．4．1 细菌培养

2．4．2 灭活条件的优化

2．4．3 免疫佐剂的选择

2．5 产气荚膜梭菌及化脓隐秘杆菌二联灭活疫苗的制备及体液免疫效果的评价

3 结果

3．1 产气荚膜梭菌及化脓隐秘杆菌生长曲线的绘制

3．2 产气荚膜梭菌及化脓隐秘杆菌小鼠感染模型的建立

3．2．1 产气荚膜梭菌小鼠感染模型的建立

3．2．2 化脓隐秘杆菌小鼠感染模型的建立

3．3 产气荚膜梭菌α毒素的粗提和抗原性鉴定

3．4 化脓隐秘杆菌PLO蛋白的表达纯化及抗原性鉴定

3．4．1 重组PLO蛋白的诱导表达及纯化

3．4．2 重组PLO蛋白的western blot鉴定

3．5 化脓隐秘杆菌PLO蛋白和产气荚膜梭菌α毒素抗体间接ELISA方法的初步建立

3．5．1 化脓隐秘杆菌PLO蛋白最佳抗原包被量和最佳血清稀释度的确定

3．5．2 化脓隐秘杆菌PLO蛋白最适包被缓冲液的选择和最佳封闭液的选择

3．5．3 产气荚膜梭菌粗提α毒素最适抗原包被浓度和血清稀释度的确定

3．6 二联灭活疫苗免疫效果的评定

3．6．1 不同灭活条件对化脓隐秘杆菌和产气荚膜梭菌免疫原性影响

3．6．2 产气荚膜梭菌及化脓隐秘杆菌不同佐剂疫苗免疫效果的比较

3．6．3 不同佐剂疫苗免疫攻毒保护试验

3．6．4 产气荚膜梭菌和化脓隐秘杆菌二联灭活疫苗免疫小鼠后抗体水平检测

3．6．5 二联灭活疫苗免疫攻毒保护试验结果

3．6．6 组织病理切片观察

4 讨论

4．1 选择重组PLO蛋白和粗提α毒素蛋白建立间接ELISA检测方法的依据

4．2 感染动物模型的建立

4．2．1 接种方式的选择

4．2．2 临床病理变化的观察

4．3 佐剂的选择及疫苗免疫原性评价

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文