TGEV双抗体夹心ELISA方法建立与胶体金免疫层析试纸条的制备

摘要

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)主要引起猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)，TGE是一种急性、高度接触性的肠道传染病，主要引起仔猪呕吐、严重腹泻、脱水，尤其两周龄以内仔猪致死率可达100％。该病传播迅速给养猪业带来极大的损失。目前对于该病的检测方法有多种，但多数适用于实验室诊断，缺少适用于现场的快速准确检测方法，以期在猪感染早期做出快速诊断，采取有效的防控措施来减少TGE爆发带来的损失。
　　 本实验主要用抗TGEV N蛋白单抗(MAb)和抗TGEV N蛋白多抗血清(PcAb)建立一种检测TGEV双抗体夹心ELISA方法。该方法选用N蛋白作为靶蛋白是因N蛋白为病毒核蛋白，具有高度保守性，在病毒中含量高，与其他病毒无交叉性反应，便于该方法准确诊断，但由于N蛋白位于病毒内部，如何从病毒中释放出N蛋白是本实验的关键。经实验研究，研制出一种病毒N蛋白裂解液，其主要成分有SDS、Tris，实验证明将裂解液与病毒混合，4℃静置30min，一抗为抗TGEVN蛋白单抗，经双抗体夹心ELISA方法检测，可以检测到裂解中病毒N蛋白。后期对裂解液进行优化组合，筛选出加入Triton-100时，病毒N蛋白能充分释放从而提高检测灵敏度。与韩国试剂盒中裂解液进行比较，临床样品作为待检样品，结果表明自制裂解液的裂解效果与后者一致，因其制备简单、操作简便，可以作为裂解TGEV及其冠状病毒的常用裂解液。
　　 病毒蛋白裂解液是建立检测TGEV双抗体夹心ELISA方法的前提，抗体的纯度是该方法建立的基础。本实验经辛酸-饱和硫酸铵法粗提纯MAb和PcAb，用蛋白A(G)亲和层析法进一步纯化，纯化后用间接ELISA、SDS-PAGE和蛋白分光光度计检测其效价、提纯结果和抗体浓度。经SDS-PADE结果显示，单抗和多抗血清经辛酸-饱和硫酸铵法粗纯化后稍有些杂带，经亲和层析方法进一步纯化后抗体没有杂带，IgG重链和轻链区带明显，纯度为100％;单抗效价由1.28×107下降为1.028×106，多抗血清的效价由1.28×106下降为5.12×105;纯化后经蛋白分光光度计检测单抗和多抗在280nm处只有一个波峰，蛋白浓度分别为2.772mg/mL和3.924mg/mL。同时对建立的双抗体夹心ELISA方法各个条件进行优化，实验结果显示，纯化抗TGEVN蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL，兔抗TGEVN蛋白PcAb工作浓度为3.5μg/mL，酶标二抗的工作浓度为1∶5000，样品最佳孵育时间为37℃60 min，阳性血清OD490nm值接近1.0，P/N值最大。
　　 为了进一步达到现场检测要求，本实验在双抗体夹心方法的原理上利用胶体金免疫层析技术，在准确的基础上快速检测TGEV，以期提高对该病的正确诊断和防治。
　　 本实验主要采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在10mL体系氯金酸溶液中加入150ul柠檬酸钠，肉眼观察胶体金颗粒颜色均一，呈酒红色，有明显光晕，经电镜观察胶体金颗粒大小一致，颗粒直径在20nm左右。经紫外扫描金颗粒，其峰宽较窄，表明胶体金溶液分散性良好。最大吸收峰为530nm，适于标记单克隆抗体。优化金标颗粒的最适条件和试纸条的组成成分，结果显示:标记最适pH值pH6.4，最佳标记量233μg/mL。选择BSA、蔗糖、海藻糖等成分作为金标抗体悬液可以提高金标记的抗体活性。将标记好的金标抗体吸附于玻璃纤维，用纯化的PcAb和羊抗鼠IgG分别作为检测线和质控线组装试纸条，TGEV培养液和未接种病毒的细胞上清液作为已知阳性和阴性样品，检测时间为10～20min，同时对试纸条进行特异性、重复性、稳定性和临床样品检测实验。试纸条判定依据为检测线和质控线均出现红色条带为阳性结果，若仅质控线出现红色条带为阴性结果。实验结果显示:试纸条不与猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒等相关腹泻病毒发生反应，表明试纸条特异性良好;做重复检测试验，结果显示无明显差异;经稳定性试验，结果显示制备的试纸条稳定性良好;将本实验制备的试纸条进行临床样品检测，并与RT-PCR方法结果比较，两者结果一致，综合以上试验验证本实验所建立的胶体金免疫层析试纸条的临床检测效果稳定可靠。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 猪传染性胃肠炎病毒的研究进展

1．1．1 TGEV的形态结构

1．1．2 TGEV的培养特性和理化特性

1．1．3 TGEV的结构蛋白与功能

1．1．4 N蛋白作为靶物质的优势

1．2 猪传染性胃肠炎流行病学研究进展

1．3 猪传染性胃肠炎病毒诊断方法

1．3．1 TGEV常规诊断方法

1．3．2 TGEV分子生物学诊断方法

1．4 免疫胶体金概述

1．4．1 免疫胶体金技术的原理

1．4．2 免疫胶体金技术的主要特点

1．4．3 免疫胶体金在兽医快速检测中的应用

1．5 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞与病毒

2．1．2 免疫原及动物

2．1．3 主要试剂和溶液

2．1．4 主要仪器设备

2．2 方法

2．2．1 TGEV N蛋白单抗腹水的制备与纯化

2．2．2 兔抗TGEV N蛋白多克隆抗体的制备与纯化

2．2．3 病毒蛋白裂解液制备及双抗体夹心法初步应用

2．2．4 双抗体夹心ELISA方法建立及优化

2．2．5 双抗体夹心ELISA方法初步评价

2．2．6 免疫胶体金颗粒的制备与纯化

2．2．7 胶体金试纸条的制备

2．2．8 胶体金试纸条各种反应条件的优化及性能评价

2．2．9 病毒蛋白裂解液优化及在试纸条上应用

3 结果

3．1 TGEV N蛋白单抗的纯化结果

3．2 抗TGEV N蛋白多克隆抗血清的制备和纯化结果

3．2．1 重组TGEV N蛋白在大肠杆菌的表达及纯化结果

3．2．2 抗猪传染性胃肠炎病毒多克隆抗血清的纯化结果

3．3 病毒蛋白裂解液在双抗体夹心ELISA方法初步应用

3．4 双抗体夹心ELISA方法建立及优化结果

3．4．1 最佳反应条件的确定

3．4．2 ELISA判定标准的确定

3．5 双抗体夹心ELISA方法初步评价结果

3．5．1 特异性试验

3．5．2 灵敏性试验

3．5．2 重复性试验

3．5．3 双抗体夹心ELISA检测方法与RT-PCR试验的比较结果

3．6 胶体金和金标抗体的质量鉴定结果

3．6．1 胶体金颗粒的质量鉴定

3．6．2 金标抗体的鉴定

3．7 金标抗体制备过程中条件的确定结果

3．7．1 胶体金标记抗体最适量的确定

3．7．2 单抗与胶体金结合最佳pH测定

3．8 免疫胶体金试纸条各种反应条件优化及性能评价结果

3．8．1 硝酸纤维素薄膜的选择结果

3．8．2 玻璃纤维素膜的选择结果

3．8．3 样品垫和吸水纸的选择结果

3．8．4 封闭剂处理结果和封闭时间的选择结果

3．8．5 金标稀释液最佳量的选择结果

3．8．6 特异性实验结果

3．8．7 稳定性实验结果

3．8．8 重复性实验结果

3．8．9 临床样品检测结果

3．9 病毒蛋白裂解液在试纸条上应用结果

3．9．1 病毒蛋白裂解液在成品试纸条上应用结果

3．9．2 病毒蛋白裂解液在自制试纸条上应用结果

3．10 临床样品在试纸条上应用结果

3．10．1 临床样品在成品试纸条上应用结果

3．10．2 临床样品在自制试纸条上应用结果

4 讨论

4．1 关于双抗体夹心ELISA方法

4．1．1 抗体IgG的纯化和选择

4．1．2 双抗体夹心ELISA方法判定标准的选择

4．2 裂解液的选择及其影响因素

4．3 金颗粒的制备与标记过程中的影响因素

4．4 试纸条的制作

4．4．1 试纸条材料的选择

4．4．2 试纸条优化试剂的选择

4．5 胶体金免疫层析试纸条在检测TGEV的潜在应用价值

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文