洋葱LFY同源基因的克隆与表达分析

摘要

洋葱(Allium cepaL.)为百合科葱属二年生草本植物，有普通洋葱、分蘖洋葱和顶球洋葱三个变种。洋葱风味独特，且有降血压、降血脂、抗动脉硬化和预防心肌梗塞的作用，现已被广泛应用于食品、医疗和保健领域，市场前景广阔。洋葱为绿体春化型植物，如何调控其抽薹开花是长期困扰其生产和育种的问题。LFY基因是植物成花调控网络中各类基因的汇集点，不仅决定着花的形态，而且影响着开花时间。克隆LFY基因，了解其表达特点，对以基因工程手段调控植物抽薹开花具有重要的意义。
　　 本研究以普通洋葱‘1007’品系为试材，采用RACE和同源基因克隆方法分离得到普通洋葱LFY同源基因cDNA序列和基因组DNA序列，使用生物信息学软件进行序列分析，采用实时荧光定量PCR技术对普通洋葱LFY同源基因进行时空表达检测;以分蘖洋葱‘Z-010’品系为试材，采用同源基因克隆法分离得到分蘖洋葱LFY同源基因cDNA序列，使用生物信息学软件进行序列分析，采用半定量RT-PCR技术对分蘖洋葱LFY同源基因进行时空表达检测。
　　 试验结论归纳如下:
　　 (1)通过RACE方法克隆得到普通洋葱LFY同源基因AcLFY，GenBank登录号为JX275962。AcLFY基因全长1285 bp，5'非翻译区长15 bp，3'非翻译区长151 bp，ORF序列全长1119 bp，编码372个氨基酸序列。AcLFY蛋白含有5'-N端脯氨酸富集区、亮氨酸拉链和酸性区等转录因子特有的结构特征。
　　 (2)采用同源基因克隆法得到AcLFY基因组序列，序列分析结果表明，AcLFY基因组序列长1263 bp，序列中包含2个内含子，大小分别为63 bp和81 bp，Intron1位于基因组序列的第387～450个碱基之间，Intron2位于基因组序列的第960～1042个碱基之间。
　　 (3) qPCR检测结果表明，AcLFY基因在洋葱抽薹初期的花序分生组织中表达量达到最大，在花托、花柄以及成形和未成形的花器官中只有微量表达，开花期的叶片中也检测到AcLFY的大量表达，说明花器官完全形成后，AcLFY mRNA主要存在于叶片中。随着花器官的发生至发育完成，叶片中AcLFY的表达呈增多的趋势。
　　 (4)同源基因克隆法分离得到分蘖洋葱LFY同源基因AcADLFY, GenBank登录号为JX275963。AcADLFY基因cDNA序列全长1119 bp，编码372个氨基酸序列，含有5'-N端脯氨酸富集区、酸性区和亮氨酸拉链结构，与普通洋葱AcLFY基因结构域极为相似，二者氨基酸序列同源性高达98.66％。
　　 (5)利用半定量RT-PCR方法对分蘖洋葱AcADLFY基因的时空表达进行初步分析，结果显示AcADLFY基因在分蘖洋葱抽薹初期的花序分生组织中有大量表达，在抽薹期的花柄、花托和花苞中表达比较微弱，其他部位几乎检测不到AcADLFY的表达。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究的目的和意义

1．2 国内外研究进展

1．2．1 植物成花机理研究进展

1．2．2 花发育相关基因研究进展

1．2．3 LFY基因研究进展

1．3 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要试剂与试剂盒

2．1．3 菌株及载体

2．1．4 试验仪器

2．1．5 引物合成与测序

2．2 试验方法

2．2．1 植物总RNA的提取

2．2．2 cDNA模板的制备

2．2．3 洋葱AcLFY基因保守区的克隆

2．2．4 3' RACE试验

2．2．5 5' RACE试验

2．2．6 洋葱AcLFY基因cDNA开放阅读框的克隆

2．2．7 洋葱AcLFY基因DNA的克隆

2．2．8 洋葱AcLFY基因的时空表达分析

2．2．9 分蘖洋葱AcADLFY基因cDNA开放阅读框的克隆

2．2．10 分蘖洋葱AcADLFY基因的半定量表达分析

2．2．11 序列结构的生物信息学分析

3 结果与分析

3．1 RNA提取结果检测

3．2 cDNA模板的检测

3．3 洋葱AcLFY基因保守区的克隆

3．4 3' RACE试验结果分析

3．5 5' RACE试验结果分析

3．6 洋葱AcLFY基因cDNA开放阅读框的克隆

3．6．1 洋葱AcLFY基因cDNA开放阅读框的克隆与序列分析

3．6．2 AcLFY的同源序列比对和系统发育树构建

3．6．3 AcLFY蛋白三维立体结构预测

3．7 洋葱AcLFY基因组DNA的克隆

3．8 洋葱AcLFY基因时空表达的qPCR检测

3．9 分蘖洋葱AcADLFY基因cDNA开放阅读框的克隆与序列分析

3．10 分蘖洋葱AcADLFY基因的半定量表达分析

4 讨论

4．1 RNA的提取

4．2 巢式PCR反应中的非特异性扩增现象

4．3 实时荧光定量PCR技术的应用

4．4 洋葱AcLFY与分蘖洋葱AcADLFY基因的结构差异

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文