沙棘叶黄酮提取物体内外抗氧化活性、应用与护肝作用的研究

摘要

目前，食品中广泛应用的抗氧化剂多以人工合成抗氧化剂为主，但由于合成抗氧化剂在毒理学上存在安全问题，其广泛应用反而成为了一种食品安全的威胁。因此，如何寻找开发利用自然界存在的天然的植物来源抗氧化剂成为研究的热点。沙棘叶中富含多种生物活性成分，是天然抗氧化剂的良好来源，其不仅能够应用于食品中抑制脂肪和蛋白的氧化，同时还具有有益人体健康的潜在功效，比如清除体内自由基、抑制肝损伤、提高肠道免疫能力等等。 本课题以蒙古大果沙棘叶为提纯对象，提纯了具有高度非特异性抗氧化活力和高浓度黄酮类含量的，沙棘叶黄酮提取物，研究了超声波辅助乙醇-盐酸溶液提取最佳工艺，提取物中主要成分分析、提取物的抗氧化稳定性，提取物在生、熟肉糜中对脂肪氧化的抑制作用，提取物对人胚肺成纤维细胞免于受到H2O2损伤的保护作用，提取物对半乳糖胺(Gal-N)诱导肝损伤大鼠的保护作用以及在对小鼠肠道黏膜免疫能力的影响。主要研究结果如下: 1、以超声波辅助乙醇-盐酸溶液对沙棘叶中的总黄酮进行提取，优化提取条件并对其抗氧化能力进行了判定。沙棘叶总黄酮提取物制备最佳加工条件为乙醇体积比50％，料液比1∶20，盐酸浓度3mol/L，提取时间30min，超声波功率80W，此工艺条件下的提取率达到6.34％。沙棘叶总黄酮具有较强的还原能力和2，2'-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTS+）自由基清除能力。 2、比较了沙棘叶黄酮提取物的抗氧化能力，将2％沙棘叶黄酮提取物与0.01％ BHA和0.01％Vc的抗氧化活性分别进行对比，沙棘叶黄酮提取物的还原能力、ABTS+自由基和超氧自由基清除率均显著高于BHA和Vc(P＜0.05);提取物的2,2-二苯基-1-间三硝基苯基联肼(DPPH)自由基和羟基自由基清除率基本和BHA的效果相当(P＞0.05)，但是始终高于Vc的DPPH自由基和羟基自由基清除率(P＜0.05)。 3、利用优化过条件后的高效液相色谱法(HPLC)分析了沙棘叶黄酮提物中的主要活性物质。提取物中主要成分有芦丁、杨梅素、槲皮素和异鼠李素，其中芦丁、杨梅素、槲皮素和异鼠李素的总含量分别达到了30.32、20.05、29.01和23.08 mg/g。 4、不同的pH值、避光保存、金属离子以及加热对沙棘叶提取物的抗氧化活性（还原能力和ABTS自由基清除活性）影响不显著(P＞0.05)，但是在阳光和日光灯照射条件下，其抗氧化活性显著降低(P＜0.05)，为沙棘叶提取物作为天然抗氧化剂在食品领域的稳定应用提供理论依据。 5、将沙棘叶黄酮提取物以0.02％、0.05％、0.10％、0.20％的添加量应用于生肉糜中，在冷藏过程中测定肉糜的色差值、pH值、羰基含量、硫代巴比妥酸值（TBARS值），安排了专业感官评价组并对肉糜的感官质量变化进行了评定。与不添加沙棘叶黄酮提取物的对阴性照组比较，提取物处理组在7天内能显著抑制猪肉蛋白和脂肪氧化过程，增加肉糜颜色的红度值，且随着添加量加大效果增加明显，与BHA效果相当。感官评价也是一样。 6、同样将0.02％、0.05％、0.10％、0.20％的沙棘叶黄酮提取物添加到熟肉糜中，在冷藏过程中测定肉糜的色差值、pH值、羰基含量、硫代巴比妥酸值（TBARS值），并对包括颜色、异味、可接受性、酸败4个感官指标做了比较评定。结果表明，添加提取物处理组对油炸后熟肉饼脂肪氧化抑制作用效果明显，在抑制熟肉糜蛋白和脂肪氧化过程效果明显，与BHA效果相当。感官评定也一样。 7、沙棘叶黄酮提取物可以对细胞起到保护作用，对试验的人胚肺成纤维细胞MRC-5，在试验中减轻了细胞遭受过氧化氢的损伤。沙棘叶黄酮提取物能够增加细胞存活几率，并且可显著提高细胞内超氧化物歧化酶（SOD酶）、过氧化氢酶（CAT酶）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px酶）的活力;同时，对细胞内的丙二醛(MDA)有显著清除作用。 8、沙棘叶黄酮提取物对半乳糖胺(Gal-N)诱导的肝损伤大鼠具有明显的保护作用。首先，沙棘叶黄酮提取物能够显著的降低Gal-N诱导的肝损伤大鼠血清中的谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶（ALT）水平(P＜0.05)，从生理角度考虑，其对大鼠的肝脏具有很好的保护以及毒物保护作用，同时对健康具有很大益处;其次，沙棘叶黄酮提取物可显著提高大鼠肝脏组织中的SOD酶、CAT酶和GSH-Px酶的活力(P＜0.05)，提高肝脏组织的总抗氧化能力(T-AOC)(P＜0.05)，并且降低肝脏组织中的MDA含量(P＜0.05)，减轻Gal-N对肝脏的损伤。 9、中剂量沙棘叶黄酮提取物灌胃可以促进小鼠肠道黏膜免疫水平，能够显著提高肠道黏膜中的分泌性免疫球蛋白A(SIgA)、白细胞介素2（IL-2）和白细胞介素4(IL-4)的含量(P＜0.05)，促进机体肠道T淋巴细胞连续分化，使机体免疫水平得到提高;同时，从干扰素γ（IFN-γ）的含量以及IFN-γ与IL-4的比值可以看出中剂量沙棘叶黄酮提取物灌胃能够提高体液免疫力，细胞免疫能力正常，对抵抗外界异物感染、保证机体肠道健康最有利。另外，高剂量组造成对异物识别敏感性减低，不利于试验动物机体肠道健康。另外由于IFN-γ与IL-4比值低于对照组，有潜在的免疫失调的可能，需要进行进一步深入研究。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 立题背景

1．2 沙棘的营养价值概述

1．3 沙棘黄酮的生理活性作用

1．3．1 抗氧化及清除自由基

1．3．2 增强机体免疫力

1．3．3 抗肿瘤作用

1．3．4 保护心血管系统

1．3．5 其他作用

1．4 沙棘资源的应用

1．4．1 沙棘在食品中的应用

1．4．2 沙棘在医药中的应用

1．4．3 沙棘在化妆品中的应用

1．4．4 沙棘在环境保护中的应用

1．5 沙棘叶中黄酮类物质的提取

1．5．1 沙棘总黄酮

1．5．2 沙棘叶黄酮的提取方法

1．5．3 沙棘总黄酮的分离纯化与分析检测方法

1．6 沙棘叶黄酮抗氧化活性的评价方法

1．6．1 体外抗氧化活性评价

1．6．2 体内抗氧化活性评价

1．7 研究目的与意义

1．8 本课题研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 原料和设备

2．1．1 原料和试剂

2．1．2 仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 沙棘叶黄酮提取条件的确定及抗氧化活性的测定

2．2．2 沙棘叶黄酮提取物HPLC分析

2．2．3 沙棘叶黄酮提取物抗氧化稳定性的研究

2．2．4 沙棘叶黄酮提取物对肉糜的抗氧化作用

2．2．5 沙棘叶黄酮提取物对H2O2引起正常成纤维细胞氧化保护作用

2．2．6 沙棘叶黄酮提取物对自由基引起的肝组织损伤保护作用的研究

2．2．7 沙棘叶黄酮提取物对小鼠肠道免疫功能的影响

2．2．8 统计分析

3 结果与分析

3．1 标准曲线的绘制

3．1．1 芦丁标准曲线

3．1．2 测定羰基含量的BSA标准曲线

3．2 沙棘叶黄酮提取物提取条件的确定及其抗氧化活性的研究

3．2．1 提取溶剂的选择

3．2．2 乙醇体积分数的确定

3．2．3 料液比的确定

3．2．4 盐酸浓度的确定

3．2．5 提取时间的确定

3．2．6 超声波功率的确定

3．2．7 沙棘叶黄酮提取物与BHA和Vc抗氧化活性的比较

3．2 应用HPLC对沙棘叶黄酮提取物成分的鉴定

3．3 不同环境条件下沙棘叶黄酮提取物的抗氧化稳定性

3．3．1 不同pH值对沙棘叶黄酮提取物抗氧化活性的影响

3．3．2 不同光照对沙棘叶黄酮提取物抗氧化活性的影响

3．3．3 不同金属离子对沙棘叶黄酮提取物抗氧化活性的影响

3．3．4 不同加热温度对沙棘叶黄酮提取物抗氧化活性的影响

3．4 沙棘叶黄酮提取物对生肉糜的抗氧化作用

3．4．1 沙棘叶黄酮提取物对生肉糜a*-值的影响

3．4．2 沙棘叶黄酮提取物对生肉糜pH值的影响

3．4．3 不同添加量的沙棘叶黄酮提取物对生肉糜羰基含量的影响

3．4．4 不同添加量的沙棘叶黄酮提取物对生肉糜TBARS的影响

3．4．5 不同添加量的沙棘叶黄酮提取物对生肉糜感官评价指标的影响

3．5 沙棘叶黄酮提取物对熟肉糜的抗氧化作用

3．5．1 沙棘叶黄酮提取物含量对熟肉糜a*-值的影响

3．5．2 不同添加量的沙棘叶黄酮提取物对熟肉糜pH值的影响

3．5．3 不同添加量的沙棘叶黄酮提取物对熟肉糜羰基含量的影响

3．5．4 不同添加量的沙棘叶黄酮提取物对熟肉糜TBARS的影响

3．5．5 不同添加量的沙棘叶黄酮提取物对生肉糜感官评价指标的影响

3．6 沙棘叶黄酮提取物对H2O2诱导的人胚肺成纤维细胞氧化损伤的保护作用

3．6．1 H2O2浓度对细胞存活率的影响

3．6．2 沙棘叶黄酮提取物浓度对细胞存活率的影响

3．6．3 沙棘叶黄酮提取物对H2O2诱导的细胞存活率的影响

3．6．4 细胞体内抗氧化酶系的变化

3．6．5 细胞体内MDA含量的变化

3．7 沙棘叶黄酮提取物对Gal-N诱导肝损伤大鼠的保护作用

3．7．1 对Gal-N诱导肝损伤大鼠血清AST和ALT水平的影响

3．7．2 沙棘叶黄酮提取物对Gal-N诱导肝损伤大鼠肝脏抗氧化酶系活力的影响

3．7．3 沙棘叶黄酮提取物对Gal-N诱导肝损伤大鼠肝脏MDA含量的影响

3．7．4 沙棘叶黄酮提取物对Gal-N诱导肝损伤大鼠肝脏总抗氧化能力(T-AOC)的影响

3．8 沙棘叶提取物对小鼠肠道免疫功能促进作用的研究

3．8．1 分泌性免疫球蛋白A(SIgA)含量的变化

3．8．2 白细胞介素2(IL-2)含量的变化

3．8．3 白细胞介素4(IL-4)含量的变化

3．8．4 干扰素γ(IFN-γ)含量的变化

3．8．5 IFN-γ与IL-4比例的变化

4．讨论

4．1 沙棘叶黄酮提取物提取条件的确定与优化

4．2 沙棘叶黄酮提取物主成分的鉴定

4．3 沙棘叶黄酮提取物的稳定性

4．6 沙棘叶黄酮提取物对Gal-N诱导肝损伤大鼠肝脏抗氧化酶系以及抗氧化能力的影响

4．7 沙棘叶黄酮提取物对小鼠肠道免疫功能影响的研究

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文