猪源肠球菌cfr基因流行特点及传播机理

摘要

细菌耐药性日趋增加和广泛传播，严重威胁着人类和动物的健康。2006年，cfr基因被发现可同时介导对酰胺醇类、林可胺类、恶唑烷酮类、截短侧耳素类及链阳菌素A共五类结构不同药物的耐药，从而引起了人们的广泛关注。肠球菌是广泛存在于自然环境、人和动物肠道中的一种正常菌群，对人类肠系菌群有调控作用，但由于其具有容易捕获耐药基因或耐药质粒的特点，加之有可能将耐药基因转移到其他致病菌中，因而可对宿主造成严重危害。近些年来，由肠球菌引发的感染越来越多，致死率也越来越高。因此，开展cfr基因在动物源肠球菌中的流行情况及传播机制的研究可为肠球菌耐药性的风险评估提供参考依据。 本研究从广州某大型猪场采集的肛门拭子和鼻拭子样品1800份中筛选到氟苯尼考低敏感肠球菌79株，经16S rRNA扩增和测序鉴定显示79株肠球菌分别为假鸟肠球菌12株、粪肠球菌12株、屎肠球菌11株、鹑鸡肠球菌26株、铅黄肠球菌16株和棉子糖肠球菌2株。对上述79株肠球菌进行多重耐药基因cfr检测，发现28株携带cfr基因，其中粪肠球菌8株，铅黄肠球菌6株，屎肠球菌4株，鹑鸡肠球菌10株。利用脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Filed GelElectrophoresis，PFGE)对28株cfr基因阳性菌株进行亲缘关系分析，共分为包括粪肠球菌3株、铅黄肠球菌2株、鹑鸡肠球菌2株和屎肠球菌1株在内的8个不同的克隆型，表明携带cfr基因的肠球菌在该猪场中存在克隆传播现象。随后，对这8株不同克隆型的肠球菌进行了耐药表型和基因型检测，发现这8株菌均呈多重耐药，对氟苯尼考、庆大霉素和红霉素的耐药率均为100％;对四环素、氨苄西林、环丙沙星和利福平也表现较高的耐药率(＞70％)。检测到氨基糖苷类耐药基因aacA-aphD、ant(6')-Ia、aac(6')-Ie-aph(2")-Ia及红霉素耐药基因erm(A)、erm(B)，其中aac(6')-Ie-aph(2")-Ia和aacA-aphD的检出率为100％, ant(6')-Ia基因的检出率为25％，erm(A)、erm(B)的检出率为50％。 Southern杂交结果显示，8株cfr基因阳性菌中，cfr在2株菌中定位于染色体，在6株菌中分别位于20-53 kb的质粒上，对定位于质粒的cfr的侧翼序列进行引物步移和测序分析，共得到2401-7368bp的序列，6株菌中发现主要的有插入序列ISEnfa5和IS256-like。上述结果显示出cfr基因在肠球菌中的流行比想象中的更为严重，且传播机制也十分复杂。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 细菌耐药的研究进展

1．2 cfr基因的研究进展

1．2．1 cfr基因的来源及作用机制

1．2．2 cfr基因的流行情况

1．2．3 cfr基因的传播机制

1．3 肠球菌及其耐药现状

1．3．1 肠球菌的概述

1．3．2 肠球菌的耐药现状

1．4 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 主要培养基及配制

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 所用药物的配置

2．1．5 所需酶及试剂盒

2．1．6 仪器耗材

2．2 方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 cfr基因阳性肠球菌的鉴定

2．2．3 脉冲场凝胶电泳(PFGE)

2．2．4 最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)测定

2．2．5 肠球菌接合转移

2．2．6 肠球菌质粒电转化粪肠球菌JH2-2

2．2．7 cfr阳性肠球菌分离株质粒DNA的提取

2．2．8 Southern Blot分析

2．2．9 cfr基因环境分析

3 结果

3．1 氟苯尼考低敏感肠球菌菌株分离鉴定

3．2 cfr基因分离鉴定

3．3 PFGE分析

3．4 药敏试验结果

3．5 耐药基因检测结果

3．6 接合子及电转子cfr基因鉴定结果

3．7 接合子及电转子PFGE鉴定

3．8 cfr基因的杂交定位

3．9 引物步移结果

4 讨论

4．1 肠球菌的初步鉴定分离方法的选择

4．2 动物源肠球菌中cfr基因流行情况

4．3 PFGE分析肠球菌同源性

4．4 cfr基因阳性肠球菌耐药表型及相关耐药基因检测

4．5 携带cfr基因肠球菌水平传播机制的研究

4．6 cfr基因定位

4．7 cfr基因环境分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文