猪卵泡抑素基因特异性表达载体的构建与表达

摘要

卵泡抑制素(follistatin，FST)是一种单链糖蛋白，也被称为卵泡休止素或者性激素抑制蛋白。它由单基因编码，编码区分为三个结构功能域，其中第一结构功能域与肌肉的生长有关，在高等动物几乎所有的组织中都有表达，具有广泛的生理作用。FST可以抑制转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β超家族中的大部分成员蛋白的活性通过与其结合，从而有利于肌纤维发生广泛的肥大和增生。FST可与肌肉生长抑素(Myostatin)的C-端结合，抑制肌肉生长抑素跟受体结合，从而促进骨骼肌发育。 本实验以民猪的FST基因为研究对象，采用克隆测序的方法得到FST基因的编码区。通过把骨骼肌特异性启动子α-actin和FST基因编码区插入到pEGFP-C1载体中构建了可以在小鼠骨骼肌细胞中特异表达的pEGFP-C1-α-actin-FST载体（P3载体）和pEGFP-C1-CMVα-actin-FST载体（P4载体）。Real-time PCR检测目的基因FST及其相关基因MYOD、MYOG、MSTN、GDF11的相对表达量。本实验研究结果如下: (1)成功克隆了猪FST基因完整编码区序列，大小为1032 bp，编码344个氨基酸。 (2)成功构建了pGL3-basic-α-actin载体（P1载体）和pGL3-basic-CMV-α-actin载体（P2载体），通过双荧光素酶活性测定，融合启动子的启动效率显著高于单独启动子的启动效率。 (3)将构建的P3载体和P4载体瞬时转染小鼠骨骼肌细胞，FST基因的mRNA水平表达量显著提高，FST基因在小鼠骨骼肌细胞中特异性高表达。 (4)在FST基因特异性高表达的小鼠骨骼肌细胞中，MSTN基因的表达量极显著升高(P＜0.01)，MYOD基因的表达量显著升高(P＜0.05)，MYOG基因和GDF11基因的表达量无显著变化。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 FST基因

1．1．1 FST基因结构特征

1．1．2 FST基因生物学功能

1．1．3 FST基因对肌肉生长的影响

1．1．4 FST基因与其他基因的互作研究

1．2 双启动子

1．3 实验目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物及细胞

2．1．2 实验试剂及耗材

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要药品的配制

2．1．5 主要生物学软件

2．1．6 实验相关生物信息学软件

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 目的片段的亚克隆

2．2．3 真核表达载体的构建

2．2．4 细胞的培养

2．2．5 瞬时转染

2．2．6 双荧光素酶活性的测定

2．2．7 统计分析

2．2．8 细胞中总RNA的提取与反转录cDNA的合成

2．2．9 Real-time PCR的检测

3 结果与分析

3．1 猪FST基因的克隆与测序结果

3．1．1 FST基因编码区的PCR扩增结果

3．1．2 重组克隆质粒PMD18-T-FST的酶切鉴定

3．1．3 民猪FST基因编码区测序结果

3．2 α-actin的基因的克隆与测序结果

3．2．1 α-actin的PCR扩增结果

3．2．2 重组质粒pMD18-α-actin的酶切鉴定

3．2．3 α-actin测序结果

3．3 P1重组质粒双酶切鉴定结果

3．3．1 pGL3-basic质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果

3．3．2 P1重组质粒菌液PCR鉴定结果

3．3．3 P1重组质粒酶切鉴定结果

3．4 P2重组质粒双酶切鉴定结果

3．4．1 pEGFP-C1质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果

3．4．2 pEGFP-C1-CMV-α-actin菌液PCR鉴定结果

3．4．3 pEGFP-C1-CMV-α-actin重组质粒酶切鉴定结果

3．4．4 CMV-actin的克隆与测序结果

3．4．5 pGL3-basic质粒与pMD18-T-CMV-α-actin质粒的酶切结果

3．4．6 P2重组质粒菌液PCR鉴定结果

3．4．7 P2重组质粒酶切鉴定结果

3．5 双荧光素酶测定结果

3．5．1 C2C12细胞、PK15细胞的培养及转染效果

3．5．2 双荧光素酶活性检测结果

3．6 P3重组质粒酶切鉴定结果

3．6．1 pEGFP-C1质粒与pMDl8-T-α-actin质粒的酶切结果

3．6．2 pEGFP-C1-α-actin与pMD18-T-FST质粒的酶切结果

3．6．3 P3重组质粒菌液PCR鉴定结果

3．6．4 P3重组质粒酶切鉴定结果

3．7 P4重组质粒酶切鉴定结果

3．7．1 pEGFP-C1质粒与pMD18-T-α-actin质粒的酶切结果

3．7．2 pEGFP-C1-CMV-α-actin与pMD18-T-FST质粒的酶切结果

3．7．3 P4重组质粒菌液PCR鉴定结果

3．7．4 P4重组质粒酶切鉴定结果

3．8 Real-time PCR的检测结果

3．8．1 从细胞中提取RNA的质量鉴定

3．8．2 FST基因及相关基因Real-time PCR的检测结果

4 讨论

4．1 载体构建

4．1．1 P1、P2重组质粒的构建

4．1．2 P3、P4重组质粒的构建

4．2 瞬时转染后细胞状态的观察

4．3 FST与MYOD、MSTN、GDF11之间的互作分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文