产气荚膜梭菌plc和NetB基因重组植物乳酸杆菌构建及其免疫保护研究

摘要

鸡坏死性肠炎(Necrotic enteritis，NE)又称鸡肠毒血症，是由A或C型产气荚膜梭菌引起鸡的一种以小肠后段肠管增粗和黏膜坏死为病变特征的急性细菌性传染病，对全球家禽生产造成重大的经济影响。本试验选择产气荚膜梭菌两个关键致病因子a毒素/磷脂酶C(a-toxin/plc)和坏死性肠炎毒素B(NetB)为抗原，构建产气荚膜梭菌plc和NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌，通过乳酸菌可表达和传递外源抗原以及乳酸菌本身可在肠道定植的特性，有效刺激肠道黏膜免疫系统，进行鸡产气荚膜梭菌新型疫苗保护机制的研究。 本文利用植物乳酸菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB，经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行SppIP诱导表达。Western Blot证明重组蛋白表达成功，并且主要以包涵体形式存在，plc和NetB重组蛋白相对分子质量分别为40 kDa和36 kDa。重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB分别电转化植物乳杆菌NC8细胞，PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明构建的pSIP409-plc/L.plantarum和pSIP409-NetB/L.plantarum具有诱导分泌plc和NetB蛋白的能力。 为研究分泌产气荚膜梭菌plc和NetB蛋白的重组植物乳杆菌作为活菌载体疫苗的免疫保护机制，进行了雏鸡免疫保护实验。免疫程序为:实验组雏鸡7-28 d连续口服1×108 cfu/d分泌产气荚膜梭菌plc和NetB蛋白重组植物乳杆菌分别进行免疫;同时设植物乳杆菌空载体和PBS组作为阴性对照;所有鸡只在42日龄以1×109 cfu/d产气荚膜梭菌ATCC13124株进行连续5d的口服攻菌。各免疫组雏鸡病理组织学观察显示重组乳杆菌对雏鸡无损害作用。对免疫雏鸡血清中抗plc和NetB蛋白特异性抗体和粪便裂解液、小肠洗液、肺泡支气管液和胆汁中特异性抗plc和NetB蛋白sIgA进行检测，结果表明口服免疫重组植物乳杆菌雏鸡血清中抗plc和NetB蛋白特异性抗体随日龄增长呈现上升趋势，且与未免疫组雏鸡有显著和极显著差异(P＜0.05，P＜0.01);免疫雏鸡粪便裂解液、小肠洗液、肺泡支气管液和胆汁中sIgA含量和前者呈现相似变化，甚至在免疫结束后一段时间仍会上升，且在实验检测期间与未免疫组雏鸡比较差异显著或极显著。攻菌后免疫组雏鸡各项指标有短暂下降后很快升高，且明显高于为免疫组雏鸡。临床症状、病理学变化、肠道病变评分、免疫器官指数计算和细菌分离计数等实验也证明pSIP409-plc/L.plantarum和pSIP409-NetB/L.plantarum对雏鸡产气荚膜梭菌攻击起到很好的保护作用。说明所构建的重组植物乳杆菌安全有效，为重组植物乳杆菌表达系统作为口服疫苗应用提供了理论依据。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 鸡坏死性肠炎

1．1．1 病原及相关毒力因子

1．1．2 鸡坏死性肠炎诱发因素

1．1．3 鸡坏死性肠炎流行特点

1．1．4 鸡坏死性肠炎的临床症状

1．1．5 鸡坏死性肠炎病理变化

1．2 鸡坏死性肠炎疫苗的研究进展

1．2．1 类毒素疫苗

1．2．2 弱毒疫苗

1．2．3 基因工程疫苗

1．3 乳酸茵作为口服疫苗传递载体研究进展

1．3．1 乳酸菌对机体免疫作用的影响

1．3．2 乳酸菌作为口服疫苗传递载体的应用前景

1．4 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 菌株及质粒

2．1．3 培养基和主要试剂

2．1．4 主要试剂配制

2．1．5 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 表达产气荚膜梭菌plc和NetB蛋白重组质粒的构建

2．2．2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB鉴定

2．2．3 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB在大肠杆菌中诱导表达

2．2．4 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NctB在植物乳杆菌中诱导表达

2．2．5 产气荚膜梭菌plc和NetB基因重组植物乳杆菌的免疫保护试验

3 结果

3．1 PCR扩增plc基因与NetB基因

3．2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB鉴定

3．2．1 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB PCR鉴定

3．2．2 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB双酶切鉴定

3．2．3 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB序列测定

3．3 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

3．3．1 重组plc蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

3．3．2 重组NetB蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

3．4 重组蛋白在植物乳杆菌中的诱导表达

3．4．1 表达plc／NetB重组植物乳杆菌PCR鉴定

3．4．2 表达plc／NetB重组植物乳杆菌Western Blot鉴定

3．4．3 表达plc／NetB重组植物乳杆菌间接免疫荧光鉴定

3．5 重组植物乳杆菌的免疫保护效果

3．5．1 重组植物乳杆菌在免疫鸡肠道定植情况

3．5．2 雏鸡免疫后抗产气荚膜梭菌plc、NetB抗体动态变化

3．5．3 雏鸡攻菌后抗产气荚膜梭菌plc、NetB抗体动态变化

3．5．4 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后细菌计数

3．5．5 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后病理剖检变化

3．5．6 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后病理组织学变化

3．5．7 重组植物乳杆菌免疫雏鸡攻菌后肠道病变评分

3．5．8 重组植物乳杆菌免疫及攻菌对雏鸡体重的影响

3．5．9 重组植物乳杆菌免疫及攻菌对雏鸡免疫器官发育的影响

4 讨论

4．1 重组质粒pSIP409-plc和pSIP409-NetB的构建

4．2 重组蛋白plc与NetB在大肠杆菌和乳酸菌中的表达

4．3 重组植物乳杆菌抗产气荚膜梭菌感染免疫效果

4．3．1 免疫雏鸡攻菌后抗产气荚膜梭菌plc、NetB抗体动态变化

4．3．2 免疫鸡攻菌后机体病理损伤、细菌定植变化

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文