肉仔鸡对不同锌源与铁源吸收的比较研究

摘要

氨基酸螯合微量元素作为第三代微量元素添加剂，具有生物学效价高、吸收率好、化学结构稳定、增强免疫力和利于环保等特点，是当前国内外研制和开发应用的热点，也成为动物营养中微量元素研究的重点和热点。科学家主要根据竞争吸收假说和完整吸收假说去解释氨基酸螯合微量元素的上述特点。迄今为止，有关氨基酸螯合微量元素吸收机理仍还是一个“黑箱”。 本研究选用肉仔鸡为试验动物，采用原位结扎试验和自然饲喂试验，供给肉仔鸡不同锌（铁）源，旨在比较肉仔鸡对不同锌（铁)源的吸收效果，并应用同步辐射技术探索氨基酸螯合锌（铁）的吸收机理。 试验主要内容包括:应用同步辐射微束荧光分析(micro-X-rayfluorescence，μ-XRF)和微束X射线吸收精细结构(micro-X-ray absorption fine structure，μ-XAFS)技术，测定供给氨基酸螯合锌（铁）后十二指肠肠壁中元素的分布和形态，研究氨基酸螯合锌（铁）的吸收机理;通过测定肉仔鸡十二指肠锌含量、金属硫蛋白含量、相关血液生化指标、相关酶活性和相关基因mRNA的相对表达量，研究肉仔鸡对不同锌源的吸收效果;通过测定十二指肠锌（铁）含量和μ-XRF二维图谱，研究日粮因素对肉仔鸡十二指肠吸收锌（铁）源的影响。 试验一:不同锌源在肉仔鸡十二指肠内的吸收特点及机理研究 试验采用单因素完全随机设计。选取75只AA肉仔鸡，按十二指肠灌注液成份分为5组:硫酸锌组、氧化锌组、赖氨酸锌组、蛋氨酸锌组、对照组。每组5个重复，每个重复3只鸡。每只鸡为十二指肠肠段原位结扎的一个重复，结扎肠段灌注3 mL等量锌（40μg/mL）的不同锌源灌注液，对照组灌注不含锌源灌注液，灌注后培养30 min。试验结束后，取中间肠段和小肠粘膜等样品进行相关指标分析。 研究结果表明:(1)根据μ-XRF技术扫描十二指肠肠壁切片的二维图谱分析，锌在肠壁中分布不均匀，高锌含量都集中在一个特定区域，这个区域是锌在肠壁中吸收的主要区域。灌注4种锌源的肠壁锌含量均比对照组高。氨基酸螯合锌组肠壁特定区域锌含量高于无机锌组，并且ZnMet组在该特定区域锌含量最高，ZnO组在该特定区域锌含量最低。说明氨基酸螯合锌进入十二指肠肠壁中锌的量较无机锌多。(2)根据4种不同锌源标品的X射线吸收精细结构(X-ray absorption fine structure，XAFS)光谱分析，Zn的K边吸收峰值在同一个能量范围内，说明4种锌源的价态相同，都是二价锌离子。但由Zn的K边结构和曲线形状明显不同，说明4种锌源标品的配位元素不同。然而，根据4种不同锌源在肠壁特定区域锌的μ-XAFS光谱分析，锌的近边吸收光谱基本一致，说明灌注4种锌源后，肠壁中锌都是以二价离子存在，并且锌的配位元素相同，其吸收形式也是一样的。综合说明，氨基酸螯合锌在肠壁中不能以整体形式被吸收。(3)氨基酸螯合锌组十二指肠锌含量、金属硫蛋白含量和十二指肠粘膜MT和ZnT1 mRNA相对表达量显著高于无机锌源组(P＜0.05)，说明肉仔鸡十二指肠对氨基酸螯合锌的吸收效果较无机锌好。 试验二:日粮因素对锌源在十二指肠内吸收的影响 试验采用双因素(4×3)完全随机设计。选取240只AA肉仔鸡，取肉仔鸡十二指肠灌注，灌注液中分别添加不同锌源40μg/mL锌溶液3 mL（以含锌量计算），分别为:硫酸锌组、氧化锌组、赖氨酸锌组、蛋氨酸锌组。并在添加4种锌源灌注液中分别添加植酸、钙、柠檬酸和组氨酸不同影响因素，使影响因素与锌摩尔比为三个水平，每组5个重复，每个重复1只鸡，每只鸡的十二指肠用做相应肠段原位结扎的一个重复。十二指肠肠段灌注后培养30min。取出中间肠段8 cm左右，用生理盐水冲洗内部和外部，然后迅速放入液氮中保存，待测肠段锌含量备用。 研究结果表明:(1)在高植酸水平作用下，氨基酸螯合锌组十二指肠锌含量受植酸水平影响较小，无显著差异（P＞0.05），无机锌组十二指肠锌含量显著降低（P＜0.05），锌源和植酸水平对肉鸡十二指肠锌含量影响有显著交互作用（P＜0.05）。(2)当Ca水平与锌摩尔比最高时，无机锌组十二指肠锌含量显著降低(P＜0.05)，锌源和钙水平对十二指肠锌含量交互作用无显著差异(P＞0.05)。(3)不同锌源十二指肠锌含量受柠檬酸水平影响差异不显著（P＞0.05），柠檬酸水平和锌源无显著交互作用（P＞0.05）。(4)添加高组氨酸水平显著提高了无机锌源组十二指肠锌含量(P＜0.05)。但却显著降低了氨基酸螯合锌组十二指肠锌含量(P＜0.05)，组酸水平对不同锌源在十二指肠中锌的吸收效果有显著的交互作用（P＜0.05）。 试验三:不同锌源自然饲喂肉仔鸡试验 试验采用单因素完全随机设计。选取60只AA肉仔鸡，共设4个饲喂组，分别为:硫酸锌组、氧化锌组、赖氨酸锌组、蛋氨酸锌组，每组5个重复，每个重复3只鸡。试验结束，取十二指肠肠段、肝脏、胰脏、胸肌、腿肌、胫骨等样品进行相关指标分析。 研究结果表明:氨基酸螯合锌组血液、肝脏和胫骨锌含量显著高于无机锌组(P＜0.05)。不同锌源对肝脏和胰脏金属硫蛋白影响无显著差异(P＞0.05)。氨基酸螯合锌组肝脏碱性磷酸酶活性较无机锌组显著升高(P＜0.05)。蛋氨酸锌组肝脏铜锌超氧化物歧化酶显著高于其它三组（P＜0.05）。不同锌源对肉鸡十二指肠形态的影响无显著差异（P＞0.05）。氨基酸螯合锌组十二指肠粘膜MT和ZnT1 mRNA相对表达量较无机锌组显著升高（P＜0.05）。十二指肠肠囊锌的XAFS光谱曲线形状和吸收峰值范围一致，说明不同锌源在十二指肠肠囊中是以同一种价态存在。Zn的K边吸收峰值由上到下依次为:ZnMet、ZnLys、ZnSO4、 ZnO，这说明氨基酸螯合锌组十二指肠锌的相对浓度明显高于无机锌组，ZnMet组锌吸收值最大，ZnO组锌吸收值最小，说明氨基酸螯合锌吸收效果较无机锌好。 试验四:不同铁源在肉仔鸡十二指肠内的吸收特点及机理研究 试验采用单因素完全随机设计。选取75只AA肉仔鸡，按十二指肠灌注液成份分为5组:硫酸亚铁、甘氨酸亚铁、三氯化铁、甘氨酸铁组、对照组。每组5个重复，每个重复3只鸡。每只鸡为十二指肠肠段原位结扎的一个重复，结扎肠段灌注3 mL等量铁(40μg/mL)的不同铁源灌注液，对照组灌注不含铁源灌注液，灌注后培养30 min。试验结束后，取中间肠段用于同步辐射μ-XRF和μ-XAFS光谱测定。 研究结果表明:(1)根据μ-XRF技术扫描十二指肠肠壁切片的二维图谱分析，灌注4种铁源组肠壁铁含量均比对照组高。灌注不同铁源组肠壁铁的分布范围各不一致，但每个彩图高铁含量都集中在一个特定区域，这个区域是铁在肠壁中吸收的主要区域。二价铁源组肠壁特殊区域铁含量较三价铁源组高，且Fe-Gly(Ⅱ)组在该特定区域含量最高。说明二价铁源在肠壁中吸收效果较三价铁源好，且Fe-Gly(Ⅱ)吸收效果最好。(2)根据对4种不同铁源标品的XAFS光谱分析，三价铁源与二价铁源铁的K边吸收峰值、谱线形状明显不同，相同价态铁源的近边结构和吸收峰值相似，从近边结够和近边吸收峰值中能明显分辨出二价铁和三价铁。然而，根据不同铁源肠壁特定区域铁的μ-XAFS光谱分析，铁的K边吸收值、谱线形状和峰值的能量范围是相同，说明4种不同铁源吸收进入肠壁特殊区域后，铁的化学价态和配位结构相同。综合说明，氨基酸螯合微量元素在肠壁中是以离子形式被吸收，符合竞争吸收假说。 试验五:日粮因素对铁源在十二指肠内吸收的影响 试验采用双因素(4×2)完全随机设计，选取80只AA肉仔鸡，取肉仔鸡十二指肠灌注，灌注液中分别添加不同铁源40μg/mL铁溶液3 mL（以含铁量计算），分别为:硫酸亚铁组、甘氨酸亚铁组、三氯化铁组、甘氨酸铁组。并在添加4种铁源灌注液中分别添加植酸和组氨酸2种影响因素，使影响因素与铁摩尔比为2个水平，每组5个重复，每个重复1只鸡，每只鸡的十二指肠用做相应肠段原位结扎的一个重复。十二指肠肠段灌注后培养30 min。试验结束后，取出中间肠段8 cm左右，用生理盐水冲洗内部和外部，然后迅速放入液氮中保存，待测备用。 研究结果表明:(1)根据十二指肠肠壁的μ-XRF二维图谱分析，高植酸水平下，FeSO4吸收进入肠壁特定区量明显减少，Fe-Gly(Ⅱ)吸收进入肠壁特定区域量也有轻微降低，FeCl3吸收进入肠壁特定区域量也受有一定抑制作用，Fe-Gly(Ⅲ)吸收进入肠壁特定区域受抑制作用较小。根据肠壁特定区域的μ-XAFS光谱分析，高植酸水平下，不同价态铁源在肠壁中的化学价态相同。(2)高组氨酸水平下，FeSO4肠壁特定区域的铁含量明显增加，Fe-Gly(Ⅱ)肠壁特定区域的铁含量显著降低，FeCl3吸收进入肠壁特定区域中铁含量变化不大。Fe-Gly(Ⅲ)肠壁特定区域的铁含量有所降低。根据肠壁特定区域μ-XAFS光谱分析，高组氨酸水平下，不同价态铁源在肠壁中的化学价态相同。 本试验得出以下结论: (1)本试验通过原位结扎技术与同步辐射（μ-XRF、μ-XAFS）技术相结合，证明氨基酸螯合锌（铁）在十二指肠肠壁中的吸收机制是相同的，在肠壁中都是以离子形式被吸收，符合竞争吸收假说。 (2)与无机锌相比，氨基酸螯合锌显著增加了肉仔鸡血液、肝脏、胫骨、十二指肠锌含量和金属硫蛋白含量，提高了肉仔鸡肝脏中碱性磷酸酶活性和十二指肠粘膜MT和ZnT1mRNA相对表达量，说明氨基酸螯合锌吸收效果优于无机锌。 (3)本试验通过原子吸收光谱和同步辐射技术，证明日粮因素对氨基酸螯合锌（铁）源吸收影响较小，对无机锌（铁）源影响较大。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 目的与意义

1．2 研究进展

1．2．1 氨基酸鳌合微量元素的概念

1．2．2 微量元素氨基酸螯合物的特性

1．2．3 微量元素氨基酸螯合物的应用研究

1．2．4 影响微量元素吸收利用因素的研究

1．2．5 微量元素锌的吸收与代谢

1．2．6 微量元素铁的吸收和代谢

1．2．7 小肠肠壁结构与吸收

1．2．8 氨基酸鳌合微量元素吸收机制假说

1．2．9 微量元素吸收的研究方法

1．2．10 同步辐射测量微量元素的优越性

1．2．11 μ-XRF和μ-XAFS在微量元素测定中的应用

1．3 研究思路

2 材料与方法

2．1 肉仔鸡原位结扎试验(不同锌源)

2．1．1 四种锌源标品及其锌标准液

2．1．2 试验动物与饲粮

2．1．3 原位结扎制作与培养

2．1．4 试验设计与处理

2．1．5 测定指标与方法

2．2 不同锌源自然饲喂肉仔鸡试验

2．2．1 四种锌源标品及其锌标准液

2．2．2 试验动物与饲粮

2．2．3 试验设计与处理

2．2．4 测定指标与方法

2．3 肉仔鸡原位结扎试验(不同铁源)

2．3．1 四种铁源标品及其铁标准液

2．3．2 试验动物与饲粮

2．3．3 原位结扎制作与培养

2．3．4 试验设计与处理

2．3．5 四种铁源标品和十二指肠肠壁铁的μ-XRF和μ-XAFS光谱测定

2．3．6 十二指肠铁含量测定

2．4 统计分析

3 结果与分析

3．1 肉仔鸡原位结扎试验(不同锌源)

3．1．1 不同锌源对十二指肠锌和金属硫蛋白含量的影响

3．1．2 不同锌源对十二指肠粘膜MT和ZnT1 mRNA相对表达量的影响

3．1．3 日粮因素对锌源在十二指肠内吸收的影响

3．1．4 同步辐射测定锌源在十二指肠肠壁中的吸收情况

3．2 不同锌源自然饲喂肉仔鸡试验

3．2．1 不同锌源对肉仔鸡血液和其它组织锌含量的影响

3．2．2 不同锌源对肉仔鸡肝、胰金属硫蛋白含量的影响

3．2．3 不同锌源对肉仔鸡肝脏酶活性的影响

3．2．4 不同锌源对肉仔鸡十二指肠形态的影晌

3．2．5 不同锌源对肉仔鸡十二指肠粘膜ZnT1和MT mRNA相对表达量

3．2．6 同步辐射测定不同锌源在十二指肠肠囊中锌的吸收情况

3．3 肉仔鸡原位结扎试验(不同铁源)

3．3．1 μ-XRF技术确定十二指肠肠壁铁通道值

3．3．2 四种铁源标品的XAFS光谱分析

3．3．3 μ-XRF技术分析不同铁源在十二指肠壁中铁元素的含量及分布

3．3．4 不同铁源标品在肠壁中的μ-XAFS光谱分析

3．3．5 μ-XRF和μ-XAFS测定高植酸水平对铁源在肠壁中吸收情况的影响

3．3．6 高植酸水平对不同铁源在肠壁中的μ-XAFS光谱分析

3．3．7 不同植酸水平对铁源在十二指肠内吸收的影响

3．3．8 μ-XRF和μ-XAFS测定高组氨酸水平对铁源在肠壁中吸收情况的影响

3．3．9 高组氨酸水平下对不同铁源在肠壁中的μ-XAFS光谱分析

3．3．10 不同组氨酸水平对铁源在十二指肠内吸收的影响

4 讨论

4．1 肉仔鸡原位结扎试验(不同锌源)

4．1．1 原位结扎技术研究肠段对元素吸收的优越性

4．1．2 不同锌源对肉仔鸡十二指肠锌和金属硫蛋白含量的影响

4．1．3 不同锌源对十二指肠MT和ZnT1 mRNA相对表达量的影响

4．1．4 日粮因素对锌源在十二指肠内吸收的影响

4．1．5 同步辐射测定不同锌源在十二指肠肠壁中锌的吸收情况

4．2 不同锌源自然饲喂肉仔鸡试验

4．2．1 不同锌源对肉仔鸡血液和其它组织锌含量的影响

4．2．2 不同锌源对肉仔鸡肝胰金属硫蛋白含量的影响

4．2．3 不同锌源对肉仔鸡肝脏酶活性的影响

4．2．4 不同锌源对肉仔鸡十二指肠形态的影响

4．2．5 不同锌源对肉仔鸡十二指肠ZnT1和MT mRNA相对表达量的影响

4．2．6 同步辐射测定不同锌源在十二指肠肠囊中锌的吸收情况

4．3 肉仔鸡原位结扎试验(不同铁源)

4．3．1 μ-XRF分析不同铁源在肠壁中铁的相对含量及分布情况

4．3．2 同步辐射分析铁源标品和铁源在肠壁特定区域的化学形态

4．3．3 高植酸水平对不同铁源在肠壁中吸收情况的影响

4．3．4 高组氨酸水平对不同铁源在肠壁中吸收情况的影响

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文