黑龙江野生黑木耳种质资源的SSR分析

摘要

黑木耳味道鲜美，营养丰富，是我国主要的食用菌之一。黑龙江作为我国黑木耳的主产区之一，具有得天独厚的地理环境，孕育有丰富的野生黑木耳种质资源。本实验对黑龙江野生黑木耳种质资源进行一个初步的探究，为新菌种的筛选驯化培育工作提供一定的理论依据;对于全面了解黑龙江地区的黑木耳种质资源以及搜集保存野生黑木耳菌株具有重要意义;此外，从分子水平上对于新菌种的知识产权保护，加强菌种监管等方面有一定的理论意义。 本实验主要有以下结果: (1)从黑龙江地区采集并分离纯化培养后共获得31株野生黑木耳菌株。 (2)对分离获得的菌株进行菌丝体培养后进行菌丝基因组DNA提取，利用基础PCR（Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应）反应体系筛选出22对SSR(Simple Sequence Reapt微卫星序列)引物，然后对SSR-PCR反应体系进行了相关的优化实验。共获得条带位点103个，其中102个多态性位点，多态性位点比例高达99％，每对引物检测出多态性位点1～10个，引物的PIC（Polymorphism Information Content引物多样性指数）值为0.47～0.91之间，平均值0.77。菌株的特异性指数介于18.046～52.458之间，具有较高的特异性，说明菌株的遗传多样性比较丰富。 (3)将SSR-PCR电泳结果记录后进行数据处理，使用NTSYS软件对生成的矩阵进行数据分析，进行了聚类分析，PCO（Principal Coordinate analysis主坐标分析）分析等。聚类分析结果在相似系数0.74处将所有黑木耳菌株分成5大类群，结果证明黑龙江野生黑木耳种质资源呈现一定的地域相关性，相同区域或邻近区域的野生黑木耳多聚集在一起，有较高的相似度，不同地区之间具有较高的多样性，其中野生菌株方正，沙河子及十八站与其他菌株遗传距离较远，可作为未来进行新菌种杂交的亲本。对供试菌株的PCO分析结果与聚类分析结果基本一致，将供试菌株分成相似的类群，其中有两个优势类群包含了很大一部分的野生菌株。 (4)实验利用9对引物11个扩增位点对所有供试菌株进行了分子身份证的构建，使每个菌株的特征数字化，更便于菌种数据的保存，处理和交流。证明利用黑木耳特异的SSR引物构建现有菌株的分子身份证数据库，为新菌种知识产物保护，同名异物和同物异名鉴定等提供一个重要的参考依据是可行的。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 黑木耳概述

1．1．1 概况

1．1．2 黑木耳生物学特性

1．1．3 黑木耳应用价值

1．1．4 木耳栽培技术

1．2 黑木耳种质资源分析方法及研究进展

1．2．1 传统生物学方法

1．2．2 生化标记

1．2．3 细胞学标记法

1．2．4 DNA分子标记

1．3 分子身份证的研究

1．4 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 SSR引物

2．1．3 培养基

2．1．4 药品及所需溶液的配置

2．1．5 仪器与设备

2．2 菌种的分离培养与基因组DNA提取

2．2．1 菌种的分离

2．2．2 菌丝体的培养及菌丝收集

2．2．3 基因组DNA提取与检测

2．3 SSR分子标记进行种质资源分析

2．3．1 SSR引物筛选

2．3．2 SSR-PCR条件设定与优化

2．3．3 退火温度的筛选

2．3．4 PCR反应体系稳定性的检测

2．3．5 SSR-PCR

2．3．6 产物检测

2．3．7 数据处理

3 结果与分析

3．1 菌种分离

3．2 基因组DNA提取

3．3 紫外分光光度计检测分析

3．4 SSR-PCR引物筛选

3．5 SSR-PCR条件优化

3．5．1 模板DNA浓度优化

3．5．2 TaqDNA聚合酶浓度优化

3．5．3 引物浓度优化

3．5．4 dNTPs浓度的优化

3．5．5 MgCl2浓度优化

3．5．6 循环次数的优化

3．5．7 退火温度的选择

3．6 SSR-PCR结果

3．7 SSR-PCR结果数据处理

3．7．1 菌株间遗传相似系数

3．7．2 UPGMA聚类分析

3．7．3 PCO分析

3．7．4 种质资源的特异性指数分析

3．7．5 平均遗传距离和平均遗传相似系数分析

3．8 分子身份证的构建

4 讨论

4．1 DNA提取方法

4．2 SSR分子标记

4．3 SSR-PCR反应条件的优化

4．4 种质资源分析方法

4．5 分子身份证

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文