GSK3β通过mTOR/S6K1途径对奶牛乳腺上皮细胞泌乳及增殖的调控

摘要

近年来，随着人们对乳和乳制品消费需要的增强，关于原料乳生产、乳制品营养和安全方面的研究也越来越深入。然而，奶牛发病率高，原料乳品质低，这一制约我国奶业发展多年的难题始终未能很好的解决。因此，如何改善乳品质、提高乳产量目前仍是研究人员关注的重要科学问题。乳蛋白和乳脂肪是构成牛乳重要营养品质的主要物质基础，利用分子生物学手段探索乳品质形成过程及其调控机制，提高牛乳中乳蛋白和乳脂肪的含量，改善乳品质在国际上也已经成为该领域的主要研究方向。近些年，研究人员发现AKT/PI3K下游的mTOR信号途径不仅可以调节细胞生长及增殖，而且营养素和激素可通过mTOR信号途径调节乳蛋白合成;类固醇调控单元结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)是脂肪合成基因重要的转录调节因子。然而，同样作为AKT下游的重要底物，糖原合成激酶3β(Glycogen synthase kinase3β，GSK3β)在奶牛乳腺上皮细胞中如何与mTOR信号途径协作影响细胞增殖及乳合成的研究较少，GSK3β对乳腺发育及泌乳的作用需要我们进一步的研究。 本试验成功的构建了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞模型，通过对GSK3β进行过表达及抑制试验，应用real time-PCR及Western blotting技术检测分析GSK3β如何调控mTOR/S6K1途径影响泌乳相关信号分子和乳蛋白表达;应用免疫荧光细胞染色法检测SREBP、GSK3β、mTOR蛋白表达及其磷酸化水平(p-GSK3β、p-mTOR)在奶牛乳腺上皮细胞(dairy cow mammary epithelial cells，DCMECs)内的表达情况;使用甘油三酯试剂盒检测细胞甘油三酯分泌的情况;应用CASY细胞活力分析仪检测体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的活力及增殖能力;应用流式细胞术检测GSK3β对细胞周期的影响，最终确定GSK3β对奶牛乳腺上皮细胞泌乳及增殖的影响。分别通过抑制试验以及添加营养素蛋氨酸调控mTOR信号途径和乳蛋白合成，进一步揭示GSK3β与mTOR/S6K1途径的相互关系。 实验结果表明，GSK3β在DCMECs的细胞核和胞质中都有分布，且主要在细胞质及细胞核膜周围表达，少量在胞核中存在。GSK3β过表达后转染24h时泌乳相关基因mTOR、S6K1、SREBP1、CyclinD1在mRNA及蛋白水平表达减少，且差异显著;与对照组相比，GSK3β转染组中β-casein表达下降，甘油三酯分泌降低，细胞活力及增殖能力与对照组相比显著下降。使用GSK3β特异性蛋白抑制剂LiC1可以显著抑制GSK3β的表达，无活性的p-GSK3β表达增加，相关蛋白与对照组相比表达显著提高;β-casein的表达及甘油三酯均比对照组显著升高，促进了细胞活力及增殖能力。使用mTOR特异性蛋白抑制剂rapamycin显著抑制mTOR的表达，从而抑制mTOR途径相关蛋白及甘油三酯的表达，而p-GSK3β无显著变化;抑制mTOR的同时抑制GSK3β的活性，泌乳相关蛋白的表达与mTOR抑制组相比差异不显著，表明rapamycin抑制了LiC1对奶牛乳腺上皮细胞的促进作用。蛋氨酸(0.6mmol/L)显著提高奶牛乳腺上皮细胞泌乳相关蛋白mRNA水平的表达，GSK3β变化不显著，mTOR途径相关蛋白的表达及甘油三酯分泌显著增加(P＜0.05)，而p-GSK3β表达下降，而且可以显著促进细胞活力及增殖能力;与Met组相比，Met+LiC1组p-GSK3β表达显著增加，细胞活力及增殖能力升高，泌乳相关蛋白表达上升且差异显著;抑制mTOR则抑制了Met对奶牛乳腺上皮细胞的促进作用。 综上所述，GSK3β影响奶牛乳腺上皮细胞中SREBP1、AKT1、mTOR、S6K1、β-casein、CyclinD1等泌乳相关信号分子基因的表达，以及对细胞增殖能力和甘油三酯的分泌有抑制作用。GSK3β抑制剂LiCl和mTOR抑制剂rapamycin对GSK3β活性和上述抑制作用有类似的作用效果。Met增强mTOR/S6K1信号途径并促进GSK3β磷酸化失活。这些结果表明mTOR/S6K1信号途径可以磷酸化失活GSK3β，从而解除其抑制作用，进而促进奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 奶牛乳腺发育及泌乳机制

1．1．1 乳腺发育过程

1．1．2 泌乳机制

1．2 泌乳信号转导通路

1．2．1 乳蛋白合成及其信号转导通路

1．2．2 乳脂合成及其信号转导通路

1．2．3 mTOR与SREBP1信号转导通路的关联

1．3 GSK3β研究进展

1．3．1 GSK3β的结构和功能

1．3．2 GSK3β相关的信号通路

1．4 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验试剂和仪器

2．1．1 实验试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养及鉴定

2．2．2 目的蛋白定位

2．2．3 目的基因GSK3β基因过表达分析

2．2．4 GSK3β基因抑制分析

2．2．5 mTOR功能抑制分析

2．2．6 蛋氨酸作用DCMECs

2．3 数据处理

3 结果与分析

3．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养及鉴定

3．1．1 DCMECs的原代及传代培养

3．1．2 DCMECs的鉴定

3．2 目的蛋白定位分析

3．3 GSK3β基因过表达分析　

3．3．1 真核表达载体pGCMV-IRES-EGFP-GSK3β的构建

3．3．2 真核表达载体pGCMV-IRES-EGFP-GSK3β的过表达分析

3．3．3 GSK3β过表达后激光共聚焦验证分析

3．4 GSK3β的功能抑制分析

3．4．1 LiCl抑制GSK3β活性

3．4．2 GSK3β活性抑制后激光共聚焦分析

3．5 mTOR功能抑制分析

3．6 Met对DCMECs泌乳的分析

4 讨论

4．1 奶牛乳腺上皮细胞培养、纯化与鉴定分析

4．2 GSK3β蛋白在细胞内的定位分析

4．3 GSK3β基因片段在DCMECs中的过表达分析

4．4 GSK3β抑制mTOR／S6K1信号通路影响奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白

4．5 mTOR／S6K1信号通路调控GSK3β失活增强奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳合成

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文