藤黄微球菌(Micrococcus luteus)KDF2及其胞外蛋白酶KRP2在腐乳中的应用研究

摘要

腐乳作为中国传统发酵豆制品的典型代表，已有1500多年的历史。但在腐乳工业化生产的今天，仍存在质量不稳定和发酵周期过长等问题。明晰发酵剂菌株的发酵特性与在腐乳发酵过程中的作用，并筛选出具有优良发酵特性的生产菌株，通过纯菌接种来生产腐乳，是解决上述问题的有效途径之一。克东腐乳是我国典型的细菌发酵型腐乳。本研究在前期工作的基础上，利用微生物技术研究了藤黄微球菌（Micrococcus luteus）KDF2的菌株特性;利用酶学技术研究了藤黄微球菌（M.luteus）KDF2胞外蛋白酶KRP2的酶学性质;在上述研究的基础上利用藤黄微球菌（M.luteus）KDF2作为发酵剂制备克东腐乳;利用藤黄微球菌（M.luteus）KDF2胞外蛋白酶KRP2进行酶法制备克东腐乳，并对其发酵过程中的理化指标进行跟踪监测;最后利用发酵工程技术，优化了藤黄微球菌（M.luteus）KDF2的发酵培养基和发酵过程参数，为酶法和纯菌接种发酵克东腐乳奠定了坚实的基础。 菌株特性的研究结果表明:藤黄微球菌（M.luteus）KDF2的最适生长温度为32℃，最适生长pH为8.0，对7％的NaCl和13％的乙醇具有较强的耐受性。 对藤黄微球菌（M.luteus）KDF2胞外蛋白酶KRP2的酶学特性研究结果表明:该酶的最佳催化温度为40℃，最佳催化pH为9.0，对9％的NaCl和8％的乙醇具有较强的耐受性，金属离子Mg2+和Ca2+可显著增强该酶的活性。 以藤黄微球菌（M.luteus）KDF2为发酵剂，对不同发酵时期的腐乳样品中水分、总酸、氨基态氮、多肽、游离氨基酸以及腐乳质构进行测定。试验结果表明:藤黄微球菌（M.luteus）KDF2制备腐乳发酵90 d，水分含量、酸度和氨基态氮分别为59.3％(≤72.00％)、0.6512 g/100g腐乳（≤1.2 g/100 g腐乳）和0.5023 g/100 g腐乳（≥0.45 g/100 g腐乳），均达到红腐乳行业标准;就多肽变化而言，发酵90 d主要峰出现在8.979 min、19.977 min、20.268 min、23.631 min和27.962 min，总峰面积为45800 mAU×s;发酵90 d游离氨基酸含量为578.3 mg/100 g腐乳，必需氨基酸含量为249.8 mg/100 g腐乳，其中呈鲜味的谷氨酸含量最多，其次为呈甜味的赖氨酸;发酵90 d硬度为200 g，黏着度为32 gsec。 将藤黄微球菌(M.luteus) KDF2胞外蛋白酶KRP2应用于腐乳的制备中，对不同发酵时期的腐乳样品中水分、总酸、氨基态氮、多肽、游离氨基酸以及腐乳质构进行测定。试验结果表明:腐乳发酵120 d，水分含量、酸度和氨基态氮分别为70.3％(≤74.00％)、2.0286 g/100g腐乳（≤1.3 g/100 g腐乳）和0.3618 g/100 g腐乳（≥0.35 g/100 g腐乳），其中水分和氨基态氮达到白腐乳行业标准，而总酸未达到白腐乳行业标准;就多肽变化而言，发酵120 d主要峰出现在12.689min、12.874min、18.354min、24.537min、28.179min和29.532min，总峰面积为20297.4 mAU×s;发酵120 d腐乳样品中游离氨基酸含量为114.8mg/100 g腐乳，必需氨基酸含量为76.6 mg/100 g腐乳，其中呈苦味的甲硫氨酸高出其阈值最多，其次为呈甜昧的赖氨酸;发酵120 d腐乳样品硬度为450 g，黏着度为33 gsec。 响应面法优化藤黄微球菌（M.luteus）KDF2培养基配方以及培养条件，试验结果表明:优化后的培养基配方为蔗糖为11.57 g/L;蛋白胨∶酵母浸粉=1∶1为32.13 g/L;，磷酸氢二钾为8.09g/L，在此条件下藤黄微球菌（M.luteus）KDF2菌落总数为4.79×109 CFU/mL。优化藤黄微球菌（M.luteus）KDF2的培养条件为最适温度为30℃;pH为8.0;装液量为50 mL/250mL;振荡频率为150 r/min，最终的活菌数为5.42×109 CFU/ml。基于上述试验结果可知，藤黄微球菌（M.luteus）KDF2适宜作为发酵剂应用于腐乳的生产;而藤黄微球菌（M.luteus）KDF2蛋白酶KRP2，不适合以单酶的形式应用于腐乳的生产，但可作为腐乳用酶制剂，将腐乳酿造过程中的酶系集中制备，应用于腐乳的酶法生产中。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 腐乳的概述

1．2．1 腐乳的发展历程

1．2．2 腐乳生产中存在的问题

1．2．3 腐乳的发酵机理

1．2．4 腐乳发酵微生物

1．3 本课题研究目的及意义

1．4 研究内容与技术路线

1．4．1 研究的主要内容

1．4．2 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 菌株来源

2．1．2 药品和试剂

2．1．3 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 菌株特性研究

2．2．2 酶学特性研究

2．2．3 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备腐乳的研究

2．2．4 酶法制备腐乳的研究

2．2．5 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2的高密度培养

2．2．6 测定方法

2．2．7 数据处理

3 结果与分析

3．1 菌株基本特性

3．1．1 温度对菌株生长的影响

3．1．2 pH对菌株生长的影响

3．1．3 NaCl对菌株生长的影响

3．1．4 乙醇对菌株生长的影响

3．2 酶学特性

3．2．1 蛋白酶KRP2酶活力

3．2．2 温度对蛋白酶KRP2活性和稳定性的影响

3．2．3 pH对蛋白酶KRP2活性和稳定性的影响

3．2．4 NaCl和乙醇对蛋白酶KRP2活性和稳定性的影响

3．2．5 金属离子对蛋白酶KRP2活性和稳定性的影响

3．3 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备腐乳

3．3．1 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备腐乳水分含量的变化

3．3．2 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备腐乳总酸度的变化

3．3．3 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备腐乳氨基态氮的变化

3．3．4 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备腐乳多肽的变化

3．3．5 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备腐乳游离氨基酸的变化

3．3．6 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备的腐乳质构的变化

3．4 酶法制备腐乳

3．4．1 酶法制备腐乳水分的变化

3．4．2 酶法制备腐乳总酸的变化

3．4．3 酶法制备腐乳氨基态氮的变化

3．4．4 酶法制备腐乳多肽的变化

3．4．5 酶法制备腐乳游离氨基酸的变化

3．4．6 酶法制备的腐乳质构的变化

3．5 菌株高密度培养

3．5．1 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2培养基配方

3．5．2 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2培养条件

4 讨论

4．1 菌株基本特性

4．2 酶学性质

4．3 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备腐乳

4．3．1 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备的腐乳中水分的变化

4．3．2 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备的腐乳中总酸的变化

4．3．3 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备的腐乳中氨基态氮的变化

4．3．4 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备的腐乳中肽的变化

4．3．5 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备的腐乳中游离氨基酸的变化

4．3．6 藤黄微球菌(M．luteus)KDF2制备的腐乳质构变化的讨论

4．4 酶法制备腐乳

4．4．1 酶法制备的腐乳中水分、总酸和氨基态氮变化

4．4．2 酶法制备的腐乳中多肽变化

4．4．3 酶法制备的腐乳中氨基酸变化

4．4．4 酶法制备的腐乳中质构变化

4．5 菌株高密度培养

4．5．1 发酵培养基的优化

4．5．2 培养条件的优化

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文