猪流行性腹泻病毒感染猪小肠上皮细胞抑制IFn-β产生及激活NF-κB机理研究

摘要

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是导致猪流行性腹泻(PED)的致病因子，可引发严重腹泻和脱水，诱发高死亡率和发病率，严重影响了世界各国养猪业的发展，并造成了严重的经济损失。虽然该病在其分子流行病学的调查、诊断、预防及治疗方面的研究已有一定的进展，但是该病的爆发仍然呈现逐年递增的趋势。为了有效的控制该病的发生，有必要深入了解PEDV的分子致病机制。其中PEDV与宿主天然免疫系统之间的相互作用的研究可以帮助人们更好的理解PEDV感染和疾病发生的分子机制。
　　PEDV感染后，不能诱导产生Ⅰ型干扰素(IFN)，为PEDV逃避宿主天然免疫反应提供了有利地条件。另外，人们发现病毒感染机体后可以根据自身的特性激活或抑制核转录因子(NF-κB)基因的转录。然而，PEDV感染不能诱导产生Ⅰ型IFN及是否激活NF-κB的具体机制仍不清楚。PEDV感染机体主要破坏猪肠道上皮组织，引起肠道充血及肠绒毛萎缩，结果导致肠上皮细胞胞浆空泡化，脱落。因此，猪小肠上皮细胞(IECs)是PEDV感染的靶细胞。为了揭示了PEDV逃避天然免疫的机制，本研究选用IECs细胞作为PEDV的感染模型，对PEDV感染IECs后天然免疫反应信号通路进行了较为系统的初步研究。
　　在病毒感染和复制时，宿主的天然免疫应答反应是抵抗其感染的第一道防线，因此，病毒抑制或逃避该免疫应答反应的能力在一定程度上也反应了病毒致病力的强弱。Ⅰ型干扰素是机体免疫应答的重要产物之一，本研究显示PEDV感染IECs细胞不仅抑制IFN-β的产生，而且还抑制双链RNA（dsRNA）诱导的IFN-β的表达。干扰素调节因子3(IRF-3)和NF-κB是诱导IFN-β发生转录的两个关键因子。我们发现PEDV感染能激活NF-κB，但不能激活IRF-3。此外，PEDV感染能明显抑制dsRNA诱导的IRF-3的核转位及IFN-β的产生。为了阐明PEDV感染抑制IRF-3激活的分子机制，我们研究了IRF-3上游的组成视黄酸诱导基因蛋白(RIG-Ⅰ)和Toll-样受体3(TLR3)信号通路的信号分子诱导IFN-β的产生。在IRF-3的上游，我们发现TANK结合激酶1(TBK1)或抑制性κB激酶ε(IKKε)介导的IFN-β的产生并不受PEDV感染的影响，但是PEDV感染却完全抑制了RIG-Ⅰ接头分子线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)及RIG-Ⅰ介导的IFN-β的产生，说明PEDV感染主要通过干扰RIG-Ⅰ信号通路中的MAVS的活性而抑制IFN-β的产生。此外，我们还发现PEDV感染只能部分抑制TIR结构域的接头分子1(TRIF)诱导的IFN-β的产生，TRIF是TLR3信号通路的组成部分。综上表明，PEDV感染抑制IFN-β的产生主要是由于阻断了RIG-Ⅰ信号通路所致。
　　NF-κB调节组成免疫系统的多种因子，包括多种前炎症因子，趋化因子、黏附分子、诱导酶的表达及细胞的增殖。但是过度激活NF-κB将会引起炎症及自身免疫性疾病，因此，人们常将NF-κB的激活也认为是多数疾病感染的标志。本研究中，我们首次报道在PEDV感染IECs细胞能激活NF-κB。在PEDV感染的细胞中，NF-κB激活特征表现在NF-κB从细胞质转移到了细胞核，而且增强了NF-κB调节基因的表达。NF-κB的激活随病毒的感染进程及剂量的增加而增强。紫外灭活的PEDV不能诱导NF-κB的激活。我们在PEDV感染的细胞中检测到IκBα蛋白有降解的趋势，这说明NF-κB的激活可能与IκBα蛋白的降解有关。为了进一步揭示PEDV诱导NF-κB激活的机制，我们研究了NF-κB激活的上游信号通路，视黄酸诱导基因基因Ⅰ样受体(RLRs)和TLRs信号通路。通过小分子RNA干扰(siRNA)试验，我们的研究结果表明PEDV可能通过TLRs信号通路中的接头分子TRIF和MyD88激活NF-κB，而与RLRs相关的RIG-Ⅰ信号通路无关。我们再次通过对TLRs家族中的TLR2，TLR3，TLR4，TLR8及TLR9基因沉默，发现在PEDV感染的细胞中TLR2，TLR3及TLR9基因沉默后明显抑制了NF-κB调节基因的表达及NF-κB的核易位，而TLR4和TLR8基因沉默并没有影响PEDV诱导NF-κB的激活。已经有研究证实病毒核酸编码的蛋白参与调节NF-κB的激活，因此，我们研究了PEDV编码的结构蛋白在NF-κB激活中的作用。通过NF-κB荧光素酶报告系统对PEDV编码的结构蛋白的筛选，我们发现PEDV核蛋白N能够诱导NF-κB的激活。同时PEDV N蛋白诱导NF-κB的激活具有剂量依赖性。通过激光共聚焦实验，我们检测到在PEDV N蛋白转染的IECs细胞中能促进NF-κB的核易位。此外，通过对N蛋白缺失突变体的研究表明，PEDV N蛋白的中间区域是激活NF-κB所必须的区域。进一步的实验证实，TLR2信号通路参与PEDV N蛋白诱导NF-κB的激活。总之，本文的研究结果为深入了解PEDV的致病的分子致病机制和免疫逃避及PED的综合防治提供了重要的理论依据。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 天然免疫概述

1．1．1 Toll-样受体(TLR)

1．1．2 TLRs介导的信号通路

1．1．3 RIG-Ⅰ-样受体(RLRs)

1．1．4 RIG-Ⅰ／MDA5介导的信号通路

1．1．5 PRRs对自身及病毒核酸的识别

1．1．6 干扰素转录激活机制

1．1．7 NF-κB途径

1．1．8 病毒逃避天然免疫应答

1．2 猪流行性腹泻(PED)的概述

1．2．1 PED的流行病学特征

1．2．2 PED的临床症状及病理变化

1．3 PEDV病原学特性

1．3．1 PEDV的分类及理化性质

1．3．2 PEDV的体外培养特性

1．3．3 PEDV的抗原性

1．3．4 PEDV的致病机理

1．4 PEDV的基因组结构特征

1．4．1 S基因和S蛋白

1．4．2 M基因和M蛋白

1．4．3 N基因和N蛋白

1．4．4 E基因和E蛋白

1．5 猪小肠上皮细胞

1．6 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种、毒株、细胞及质粒

2．1．2 主要试剂、药品、工具酶和抗体

2．1．3 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 PEDV的增殖

2．2．2 PEDV感染力(TCID50)的测定

2．2．3 质粒的构建

2．2．4 siRNA的合成

2．2．5 细胞转染

2．2．6 荧光定量RT-POR检测基因mRNA水平

2．2．7 细胞核和细胞质的提取

2．2．8 组织样品蛋白的提取

2．2．9 Western blot检测目的蛋白

2．2．10 双荧光素酶检测实验

2．2．11 免疫组化实验

2．2．12 激光共聚焦显微镜观察

2．2．13 统计学方法

3 结果与分析

3．1 PEDV感染猪小肠上皮细胞(IECs)

3．2 PEDV感染IECs细胞抑制Ⅰ型IFN产生分子机制的研究

3．2．1 PEDV感染不能激活Ⅰ型IFN-β的转录

3．2．2 PEDV感染能激活NF-κB，但是不能诱导IRF-3的激活

3．2．3 PEDV感染抑制poly(I∶C)诱导的IFN-β的表达

3．2．4 PEDV感染抑制poly(I∶C)诱导IRF-3的核易位

3．2．5 PEDV不抑制TBK1／IKKε的激活

3．2．6 PEDV抑制RIG-Ⅰ介导的信号通路

3．2．7 PEDV部分抑制TRIF介导的信号通路

3．3 PEDV感染激活NF-κB的分子机制

3．3．1 猪p65基因的扩增

3．3．2 猪p65基因的重组真核表达质粒的构建

3．3．3 猪p65蛋白结构分析

3．3．4 P65蛋白系统发生树

3．3．5 猪p65的组织表达差异分析

3．3．6 PEDV感染诱导NF-κB发生核易位

3．3．7 PEDV激活NF-κB与病毒的剂量及复制密切相关

3．3．8 PEDV感染诱导IκBα蛋白降解

3．3．9 TLR通路参与PEDV诱导的NF-κB活化

3．3．10 TLR2、TLR3和TLR9通路参与PEDV诱导的NF-κB活化

3．3．11 PEDV编码结构蛋白激活NF-κB的研究

4 讨论

4．1 猪小肠上皮细胞

4．2 PEDV感染IECs抑制IFN-β产生

4．3 猪p65基因的克隆及其功能鉴定

4．4 PEDV感染IECs诱导激活NF-κB

4．5 PEDV N蛋白在IECs细胞中表达能诱导激活NF-κB

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文