串联表达蛋白A/G/L Ig结合结构域及其在口蹄疫鉴别诊断中的应用

摘要

金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal proteinA，SPA)、链球菌（C和G群）蛋白G(Streptococcal protein G，SPG)和大消化链球菌蛋白L(Peptostreptococcus protein L，PPL)是典型的免疫球蛋白结合蛋白。它们能结合大多数哺乳动物的免疫球蛋白，但结合方式和结合谱不同。三种蛋白可以优势互补，不仅有更好的结合能力，还具有更广的结合谱，有很好的应用前景。
　　本研究选取PPL B3结构域进行基因优化，与现有的AG串联基因形成不同拷贝数的AGL基因，连接到pET-30a(+)原核表达载体中，构建pET-30a(+)-L、pET-30a(+)-AGL、pET-30a(+)-[AGL]2、 pET-30a(+)-[AGL]3四种重组表达载体。经原核表达系统得到4种重组蛋白即L、AGL、[AGL]2、[AGL]3，均为可溶性表达。经Ni-NTA亲和层析纯化得到的四种蛋白L、AGL、[AGL]2、[AGL]3，其中[AGL]2重组蛋白表达量高而且纯化回收率高。Western blot分析鉴定AGL、[AGL]2、[AGL]3蛋白均能与牛血清发生特异性反应。Westernblot和间接ELISA分析结果显示[AGL]2重组蛋白与可与9种哺乳动物Ig反应，而且结合能力强于[AG]3重组蛋白。
　　对[AGL]2重组蛋白进行HRP标记（过碘酸钠法），经直接ELISA方法测定[AGL]2-HRP有很高的结合兔IgG活性。Dot-ELISA和间接ELISA结果显示[AGL]2酶标蛋白可结合9种哺乳动物Ig，而且[AGL]2酶标蛋白结合人IgM和人IgA能力强于[AG]4酶标蛋白。经验证，[AGL]2酶标蛋白可检测兔源免疫抗体;特异性检测牛、犬、鹿、猪、羊血清中的布鲁氏菌病抗体;特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体。随后，以本实验室建立的8BF-ELISA检测FMDV方法为基础，优化各个反应条件，最终建立了可检测牛、猪、羊、鹿的口蹄疫AGL-ELISA方法。应用AGL-ELISA检测了12个牧场904份牛血清，174份猪血清，292份羊血清和80份鹿血清，FMDV阳性率从0～76.19％不等。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 金黄色葡萄球菌蛋白A

1．1．1 SPA的简介

1．1．2 SPA的理化性质

1．1．3 SPA的结构特性

1．1．4 SPA的生物学特性

1．1．5 SPA的免疫学应用

1．2 链球菌蛋白G

1．2．1 SPG简介

1．2．2 SPG的理化性质和结构特性

1．2．3 SPG的生物学特性

1．2．4 SPG的应用

1．3 大消化链球菌表面蛋白L

1．3．1 PPL简介

1．3．2 PPL的理化性质和结构特性

1．3．3 PPL的生物学活性

1．3．4 PPL的应用

1．4 多物种共患传染病及检测方法

1．4．1 多物种共患传染病简介

1．4．2 口蹄疫

1．4．3 布鲁氏杆菌病

1．5 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 重组质粒、菌株

2．1．2 生物学试剂、血清和抗体

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 重组蛋白[AGL]n基因的设计、串联、表达

2．2．2 串联AGL基因载体pET-30a(+)-[AGL]n的构建

2．2．3 [AGL]n蛋白的原核表达

2．2．4 重组蛋白[AGL]n免疫球蛋白结合活性的鉴定

2．2．5 标记蛋白与多种动物Ig结合活性分析

2．2．6 [AGL]2-HRP应用于检测BoIFN-α多克隆抗体

2．2．7 [AGL]2-HRP应用于布鲁氏菌病和BVDV临床样品检测

2．2．8 [AGL]2-HRP用于8BF-ELISA

3 结果

3．1 重组克隆载体pET-30a(+)-AGL的构建

3．1．1 B-PPL多肽的基因优化

3．1．2 重组质粒pJWF-PPL的鉴定

3．1．3 重组克隆载体pET-30a(+)-AGL构建

3．2 [AGL]n蛋白的表达和鉴定

3．2．1 串联AGL基因表达载体pET-30a(+)-[AGL]n的构建

3．2．2 重组蛋R[AGL]n的诱导表达与纯化

3．2．3 重组蛋白[AGL]n的Western bolt鉴定结果

3．3 酶标蛋白的制备与鉴定

3．3．1 重组[AGL]2蛋白标记

3．3．2 酶标蛋白活性检测

3．4 酶标蛋白活性分析

3．5 酶标[AGL]2蛋白应用于检测BoIFN-α多克隆抗体

3．6 酶标蛋白用于布鲁氏杆菌病和BVDV临床样品检测

3．7 酶标蛋白用于8BF-ELISA检测FMD方法的建立

3．7．1 AGL-ELISA相关条件确定

3．7．2 AGL-ELISA重复性试验

3．7．3 AGL-ELISA特异性试验

3．7．4 AGL-ELISA保存期试验

3．7．5 AGL-ELISA与3ABC-I-ELISA试剂盒比较

3．7．6 AGL-ELISA检测猪血清、羊、鹿血清反应条件的确立

3．7．7 AGL-ELISA检测多种动物FMD临界值的确定

3．8 AGL-ELISA在临床检测中的应用

4 讨论

4．1 选取SPA、SPG、PPL单结构域的依据

4．2 串联基因AGL的构建策略和生物信息学特征

4．3 AGL-ELISA方法中动物血清相关条件的选择

4．4 AGL-ELISA在多物种共患病检测中的应用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文