保加利亚乳杆菌CcpA基因的敲除及其抗胁迫能力的研究

摘要

在乳酸菌发酵剂的生产过程中，乳酸菌会遇到冷冻、干燥和高渗等不利条件的影响，造成乳酸菌细胞膜损伤和破坏、细胞衰亡、失去活性、导致发酵剂产品质量降低，这些不利条件对乳酸菌的胁迫已经成为制约其工业化的瓶颈。乳酸菌在变化的环境中能通过改变自身代谢增强对外界环境的抵抗力。研究发现，碳分解代谢阻遏蛋白CcpA能够调控诸多应激反应蛋白，是微生物抗胁迫的重要调控因子。因此，本研究重点分析CcpA缺失对保加利亚乳杆菌的影响，通过对比野生菌和突变菌在生长代谢、关键酶活以及抗胁迫方面的变化，探讨CcpA与菌株抗胁迫的关系，为下一步抗胁迫机理的研究做铺垫。
　　本研究以德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）ATCC11842为研究对象。利用同源重组的方法获得CcpA突变菌株，分别从生长代谢、关键酶活和抗逆性进行对比分析。通过高效液相色谱法分析葡萄糖和有机酸代谢情况，通过分光光度法和比色法分析关键酶活性变化情况。
　　研究结果显示:CcpA基因缺失后，德式乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842的生长受到抑制。与原始菌株（野生菌）相比，在相同条件下培养时，CcpA突变菌进入稳定期的时间比野生菌迟缓4h左右，均步入稳定期后，CcpA突变菌的菌体密度比野生菌低23.08％。
　　CcpA缺失对葡萄糖消耗速率有一定的影响。有氧培养时，野生菌的葡萄糖消耗速率比突变菌高15.30％（P＜0.05），无氧培养时则高7.98％(P＜0.05);对同一菌株而言，有氧培养时对葡萄糖的消耗均大于无氧培养，其中野生菌为5.47％（P＜0.05），突变菌为12.62％（P＜0.05）。另外，CcpA缺失对乳酸和乙酸的生成速率也有一定的影响。有氧培养时，野生菌的乳酸生成速率比突变菌高47.62％(P＜0.05)，无氧培养时野生菌的乳酸生成速率比突变菌高21.87％（P＜0.05）;对同一菌株而言，无氧培养时乳酸生成速率均大于有氧培养，其中野生菌为23.94％(P＜0.05)，突变菌为50.13％(P＜0.05)。对乙酸而言，有氧培养时，突变菌的乙酸生成速率比野生菌高47.73％(P＜0.05)，无氧培养时两者差异不显著。
　　通过对比分析野生菌和突变菌的糖酵解途径关键酶活性的变化得出，在有氧条件下，CcpA突变菌的胞内乳酸脱氢酶的活力比野生菌的胞内乳酸脱氢酶的活力降低了72.22％(P＜0.05)，磷酸果糖激酶活力降低了60.07％(P＜0.05)，丙酮酸激酶活力降低了70.58％（P＜0.05）;无氧条件下，其胞内乳酸脱氢酶活力降低了36.75％(P＜0.05)，磷酸果糖激酶活力降低了62.87％（P＜0.05），丙酮酸激酶活力降低了29.05％（P＜0.05）。无论是有氧培养还是无氧培养，CcpA缺失后乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性均显著降低，说明CcpA蛋白参与这三种酶的激活调控，当CcpA缺失后，三种酶的活性下降。
　　CcpA缺失后，菌体的耐热性下降，菌体密度只有原对照组的3.14％（P＜0.05）。在不同培养条件下CcpA突变菌对冷的耐受性不同。有氧培养时，0～12d内突变菌的菌体密度是野生菌的48.42％;无氧培养时，突变菌的菌体密度只有野生菌的8.16％。对同一菌株而言，有氧培养时菌体耐冷性均比无氧培养时高，其中野生菌高出7.93％(P＜0.05)，突变菌则高出91.52％(P＜0.05)。
　　研究结果表明:利用同源重组的方法分别构建CcpA敲除载体pCT和打靶片段，将敲除载体pCT和打靶片段电转化至德式乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842中，成功获得CcpA基因缺失的突变菌。实验表明，CcpA突变菌的乳酸脱氢酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性下降显著，糖酵解途径关键酶活的下降直接导致糖酵解途径减弱，进而出现葡萄糖利用率降低和生长速率下降的现象，由此推断，CcpA蛋白是糖酵解关键酶调控的总因子;对野生菌而言，有氧培养和无氧培养时的酶活差异显著;而突变菌酶活性差异不显著，推断CcpA参与了菌体呼吸链的调控。CcpA突变菌的耐热性和耐冷性显著下降，抗氧化损伤能力显著提高，推断CcpA参与热激蛋白和冷激蛋白的正调控，参与抗氧化蛋白的负调控。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 文献综述

1．2．1 保加利亚乳杆菌

1．2．2 乳酸菌应激反应

1．2．3 碳分解代谢阻遏蛋白

1．2．4 基因敲除概述

1．3 本研究的目的与意义

1．4 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 质粒

2．1．3 工具酶和试剂盒

2．1．4 培养基

2．1．5 常规试剂

2．1．6 常用贮备液的配置

2．2 主要仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 基因敲除载体和打靶片段的构建

2．3．2 基因敲除突变株的筛选和鉴定

2．3．3 生长曲线的建立

2．3．4 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌糖代谢的影响

2．3．5 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌糖酵解关键酶活性的影响

2．3．6 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌抗胁迫的影响

2．4 统计学分析

3 结果与分析

3．1 重组质粒pBackZero-CcpA的构建和鉴定

3．1．1 目的菌基因组DNA的提取

3．1．2 CcpA基因敲除

3．1．3 阳性重组克隆pBackZero-CcpA的筛选

3．1．4 阳性重组克隆pBackZero-CcpA的鉴定

3．1．5 pBackZero-CcpA的提取及酶切验证

3．1．6 阳性克隆的序列测定

3．2 重组质粒pBackZero-Tet的构建和鉴定

3．2．1 Tet基因的扩增

3．2．2 Tet基因的纯化

3．2．3 阳性重组克隆pBackZero-Tet的筛选

3．2．4 菌落PCR的鉴定结果

3．2．5 pBackZero-Tet的提取及酶切验证

3．2．6 阳性克隆的序列测定

3．3 重组质粒pCT的构建和鉴定

3．3．1 目的片段的获取

3．3．2 pCT基因打靶载体的鉴定

3．3．3 基因打靶片段的构建

3．4 基因缺失突变株的筛选和鉴定

3．4．1 基因缺失突变株的筛选

3．4．2 基因缺失突变株的鉴定

3．5 保加利亚乳杆菌生长曲线的建立

3．6 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌糖代谢途径的影响

3．6．1 CcpA缺失对葡萄糖利用率及消耗率的影响

3．6．2 CcpA缺失对乳酸及乙酸代谢的影响

3．7 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌糖酵解关键酶活性的影响

3．7．1 蛋白质定量

3．7．2 乳酸脱氢酶活性

3．7．3 磷酸果糖激酶活性

3．7．4 丙酮酸激酶活性

3．8 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌抗胁迫的影响

3．8．1 热

3．8．2 冷

3．8．3 氧化

4 讨论

4．1 CcpA突变菌的构建

4．1．1 载体选择

4．1．2 同源臂长度

4．1．3 抗性筛选

4．1．4 酶切位点选择

4．1．5 电转化

4．2 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌生长代谢的影响

4．3 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌糖酵解关键酶活性的影响

4．4 CcpA缺失对保加利亚乳杆菌抗胁迫的影响

4．5 CcpA与细胞呼吸

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文