黑龙江省新生仔猪病毒性腹泻RT-PCR检测及LAMP检测方法的建立

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）引起的一种严重的病毒性传染病。该病毒属于尼多病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属成员，可以引起新生仔猪严重的呕吐、腹泻、脱水为主要特征的高度接触性肠道传染病，各个年龄阶段的猪群都会发病，哺乳仔猪病死率高达100％。自2010年冬季以来，新生哺乳仔猪的腹泻病开始在全国各地规模化猪场暴发，本次流行的腹泻病具有发病日龄早、死亡率高的新特点。为此本研究在2013-2014年黑龙江省6个地级市的10座规模化猪场采取新生哺乳仔猪临床表现为腹泻症状的粪便与小肠进行实验室RT-PCR病原检测分析，结果表明黑龙江省地区规模化猪场新生仔猪PEDV RT-PCR检出率为56％，PEDV+TGEVRT-PCR检出率为6％，PRV RT-PCR检出率为10％，TGEV RT-PCR检出率为10％，表明引起黑龙江省规模化猪场新生仔猪腹泻的主要病原是PEDV，同时也存在与其他腹泻病毒的混合感染，由于PEDV-M基因比较稳定，是研究PEDV遗传变异的优先选择基因，因此针对阳性病料扩增出6条PEDV-M基因序列进行遗传进化分析，这6条PEDV-M基因序列之间的核苷酸同源性为98.2％～99％，与疫苗株CV777的核苷酸同源性为97.6％～98.2％。利用MEGA6.0进行遗传进化树的构建，扩增出的6条PEDV-M基因的遗传进化树分为二个大系，大部分遗传距离较近，处于同一分支。其中LJJHD-M-13和LJJQ-M-14与泰国KU06RB08、泰国KU07RB08的亲缘关系较近，LJJC-M-14、LJJJ-M-14、LJJH-M-13、LJMM-M-14这四株毒株与韩国M1595、韩国CPF259的亲缘关系较近，同时扩增出的6条PEDV-M基因不与CV777毒株为一系，与其亲缘性较远。说明这些地区的PEDV流行毒株已经发生变异，形成独特的流行进化分支，因此新的疫苗毒株和免疫方法的研究对预防和控制该病具有重要的意义。
　　本研究进一步建立了PEDV的RT-LAMP检测方法。根据GenBank中发表的PEDV基因序列，用DNAstar软件进行分析对比后，针对PEDV-N基因进行引物设计。利用PrimerExplorer5.0软件设计引物，经过严格筛选，最终确定一组引物，包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP。用此引物对病毒RNA进行RT-LAMP反应，并对实验反应条件进行了优化。结果表明，RT-LAMP检测方法的最佳反应条件为:反应温度为61℃，反应时间为50min，Mg2+2.5μL，dNTPs1.5μL，外引物和内引物最佳浓度比为1∶4，即外引物(F3∶B3=1∶1)为1μL，内引物(FIP∶ BIP=1∶1)为4μL。经过灵敏性、特异性、稳定性试验，结果表明，RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍，特异性强，且稳定性好。用本实验建立的RT-LAMP方法对125份样品提取的RNA进行检测后，与RT-PCR方法检测结果对比，二者符合率为100％，该检测方法，具有操作简便、敏感性高、特异性强、不需要昂贵的仪器设备，非常适合基层的检疫部门对猪流行性腹泻的监测与防控，在现实中具有广阔的应用价值。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 PEDV国内外流行现状

1．1．1 PEDV病原学特征

1．1．2 PED流行特点与临床症状

1．1．3 PEDV发病机理与病理变化

1．1．4 PEDV实验室检测方法

1．2 环介导等温扩增研究进展

1．2．1 环介导等温扩增技术(LAMP)概述

1．2．2 环介导等温扩增技术原理

1．2．3 环介导等温扩增在病原检测方面的优势

1．3 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 临床样本与毒株

2．1．2 引物

2．1．3 主要分子生物学试剂

2．1．4 主要溶液及其配制

2．1．5 主要实验仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 黑龙江省新生仔猪病毒性腹泻RT-PCR检测

2．2．2 PEDV RT-LAMP检测方法的建立

3 结果与分析

3．1 流行病学调查结果

3．1．1 黑龙江省新生仔猪病毒性腹泻检测结果

3．1．2 PEDV-M基因的扩增及其遗传进化分析

3．2 PEDV RT-LAMP检测方法的建立

3．2．1 常规RT-PCR方法对PEDV细胞毒的检测结果

3．2．2 常规LAMP扩增反应体系对PEDV细胞毒的检测结果

3．2．3 RT-LAMP反应体系的优化结果

3．2．4 RT-LAMP检测方法反应条件的确定

3．2．5 RT-LAMP检测方法的特异性检测结果

3．2．6 RT-LAMP检测方法的灵敏性检测结果

3．2．7 RT-LAMP检测方法的稳定性试验结果

3．2．8 RT-LAMP与RT-PCR检测方法的比较分析

4 讨论

4．1 黑龙江省新生仔猪病毒性腹泻检测结果及遗传进化分析

4．2 RT-LAMP方法在PEDV病原检测中的应用及优势分析

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文