马铃薯纺锤块茎类病毒的qRt-PCR检测及其遗传进化分析

摘要

马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)是影响中国马铃薯生产的重要病原，一般可引起马铃薯植株矮化，叶片皱缩，块茎变小、畸形，产量下降等。该病害可以通过机械、无性繁殖以及实生种子等多种途径传播。目前，中国有很多马铃薯育种材料（包括种质资源和育成的品系等）已经感染了PSTVd，而PSTVd又很难通过茎尖组织培养脱除，且可以通过种子传递给下一代，因此，PSTVd已经给中国马铃薯育种工作带来了极大的困扰，更给马铃薯育种工作埋下了巨大的隐患。目前，防治的主要方法是生产健康（无马铃薯纺锤块茎类病毒）的脱毒马铃薯种薯。在马铃薯种薯的生产过程中，对脱毒马铃薯种薯/苗进行田间、库房和实验室检测是种薯/苗质量控制的最基本、最关键和最重要的手段。目前，中国在PSTVd研究方面存在以下几方面问题:(1)PSTVd检测技术体系尚不完善;(2)中国的马铃薯纺锤块茎类病毒发生、系统发育情况及致病力尚不十分清楚;(3)不同马铃薯品种感染PSTVd的症状复杂、不明确等。针对以上问题，开展了系列研究，并取得了以下结果:
　　(1)建立了PSTVd的qRT-PCR检测体系:设计了3组引物并从中筛选出最适引物对PSTV-234F和PSTV-356R。利用这对引物，结合设计的Taqman探针(PSTV-251T)，通过优化反应条件，建立了PSTVd的qRT-PCR检测体系。该检测体系不仅具有很高的检测灵敏度，检测极限为31.1拷贝/μL（101.17 ag/μL），而且具有非常好的稳定性。这一体系已经被成功地应用到马铃薯样品的检测。该体系的建立不仅丰富了PSTVd的检测手段，而且能够进一步提高PSTVd检测的准确性。
　　(2) PSTVd发生情况调查及中国分离物的序列分析:2009年～2014年间，对1000余份马铃薯种薯/苗样本进行了PSTVd调查，结果显示，在此期间，PSTVd每年都有发生，平均感染率为6.5％。本研究测定了来自黑龙江、吉林、辽宁、山东、内蒙古和陕西共6个省份的71个不同样本中的PSTVd序列。序列分析发现，每个分离物中至少含有一种主流序列，共获得74条主流序列。这些主流序列包含42种不同的序列变体(Accession numbersKR611334～KR611376)。BLAST结果表明，在42种不同的序列变体中，有12种与GenBank中登录的PSTVd的序列相同，而其余30种则是新的PSTVd变体，目前仅从中国分离得到。这些序列的获得为理解PSTVd的传入、流行、遗传变异等问题奠定了基础。首先，分析了中国流行的PSTVd序列变体，发现在中国流行的变体与其他国家的PSTVd分离物具有很高的序列相似性或者完全一致;其次，在中国，除弱毒株系外，从中国还分离到3种PSTVd中间株系，表明PSTVd中国分离物具有不同的致病性;此外，对获得的42种不同的PSTVd序列变体与GenBank中登录的165条自然条件下分离出PSTVd的序列进行了系统发育分析。整体上，PSTVd可以被分成两组（第1组和第Ⅱ组），第Ⅱ组能够被进一步分为三个亚组（亚组A～C）。所有的中国PSTVd分离物均被包含在第Ⅱ组，而且总是与俄罗斯的分离物聚在一起，这表明中国和俄罗斯的PSTVd可能具有相同的起源。最后，对42种不同的中国PSTVd变体的突变位点进行了系统分析，发现绝大部分的变体通过一个位点的突变就可以联系到一起，这表明突变可能是中国PSTVd分离物进化的主要动力。
　　(3) PSTVd中国分离物的致病性验证及不同马铃薯品种感染PSTVd的症状表现。将PSTVd中国分离物接种到4个马铃薯主栽品种（荷兰15，夏坡地，克新18和尤金）后，观察症状表现，调查株高、叶片、单株产量、块茎外观等指标。观察发现4个品种均不同程度地表现出植株矮化、叶片皱缩、块茎变小、产量降低和块茎畸形等症状。说明这4个马铃薯品种对PSTVd的侵染均是敏感的。数据统计结果表明，与对照相比，感病植株的平均株高降低30.1％，平均单株产量降低40.2％。这些结果表明:虽然PSTVd中国分离物可能是弱毒株系，但其对马铃薯生产仍然具有严重的影响。此外，不同品种感染PSTVd后有不同的症状表现，在进行田间和库房检测时应注意品种之间的差异。
　　总之，本研究建立了PSTVd qRT-PCR检测技术体系，提高了PSTVd的检测灵敏度和准确性;通过多年的调查与分析掌握了目前PSTVd在中国北方的发生情况;通过系统发育分析对中国PSTVd分离物进行了系统研究，基本掌握了PSTVd中国分离物的分子进化关系及系统发育情况;通过PSTVd接种马铃薯鉴定，推测了PSTVd中国分离物的致病力情况，并了解了不同马铃薯品种感染PSTVd后植株和块茎的表现，为PSTVd田间和库房检测提供了技术指导。以上工作为PSTVd的防控、风险评估等工作奠定了基础，同时为解决PSTVd对马铃薯育种工作造成的影响提供了防控的技术手段。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 马铃薯与马铃薯生产概况

1．1．1 世界马铃薯生产

1．1．2 中国马铃薯生产

1．2 马铃薯种薯生产及质量控制

1．2．1 马铃薯种薯发展历程

1．2．2 马铃薯种薯生产的基本模式

1．2．3 影响马铃薯种薯质量的主要病害

1．2．4 脱毒马铃薯种薯的质量控制

1．3 类病毒

1．3．1 类病毒的历史、分类

1．3．2 类病毒的生物学特性

1．3．3 类病毒的结构

1．4 马铃薯纺锤块茎类病毒

1．4．1 马铃薯纺锤块茎类病毒的寄主范围

1．4．2 马铃薯纺锤块茎类病毒的传播途径

1．4．3 马铃薯纺锤块茎类病毒的危害

1．4．4 马铃薯纺锤块茎类病毒对马铃薯育种工作的影响

1．5 马铃薯纺锤块茎类病毒的防控

1．5．1 建立完善的PSTVd检测技术体系，生产健康马铃薯种薯

1．5．2 培育抗性品种

1．5．3 利用基因工程方法

1．5．4 卫生防疫

1．5．5 加强马铃薯育种过程中PSTVd的监控，避免PSTVd在育种过程中传播

1．6 研究的目的意义

2 马铃薯纺锤块茎类病毒qRT-PCR检测技术体系的建立及应用

2．1 材料与方法

2．1．1 供试材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 RNA提取及反转录

2．2．2 引物及探针的设计及合成

2．2．3 标准品制备

2．2．4 qPCR标准曲线的建立及引物的筛选

2．2．5 检测灵敏度分析

2．2．6 qRT-PCR检测稳定性分析

2．2．7 qRT-PCR检测马铃薯样品

2．3 结果

2．3．1 阳性菌落及其PCR鉴定

2．3．2 引物的比较和筛选结果

2．3．3 检测灵敏度

2．3．4 qRT-PCR检测稳定性

2．3．5 qRT-PCR检测技术体系的应用

2．4 讨论与结论

3 马铃薯纺锤块茎类病毒发生情况调查及其分子多态性和系统进化分析

3．1 材料与方法

3．1．1 PSTVd发生情况调查

3．1．2 样品保存

3．1．3 克隆和测序

3．1．4 Taq DNA聚合酶的保真性验证

3．1．5 序列比对、系统发育分析

3．1．6 二级结构预测

3．2 结果与分析

3．2．1 马铃薯纺锤块茎类病毒的发生率

3．2．2 马铃薯纺锤块茎类病毒的PCR产物测序

3．2．3 基因克隆获得的PSTVd序列

3．2．4 马铃薯纺锤块茎类病毒的分子多态性

3．2．5 Taq酶保真度测试

3．2．6 突变对二级结构的影响

3．2．7 中国流行的马铃薯纺锤块茎类病毒变体

3．2．8 马铃薯纺锤块茎类病毒的系统发育分析

3．3 讨论与结论

3．3．1 讨论

3．3．2 结论

4 PSTVd中国分离物的致病性验证及不同马铃薯品种感染PSTVd的症状表现

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 PSTVd序列测定结果

4．2．2 株高

4．2．3 单株产量

4．2．4 叶片症状

4．2．5 块茎症状

4．2．6 PSTVd经保存和与寄主互作后的序列变化

4．2．7 PSTVd经试管保存和与寄主互作后的序列变化及其对二级结构的影响

4．3 讨论与结论

4．3．1 讨论

4．3．2 结论

5 全文结论

5．1 建立了PSTVd qRT-PCR检测体系

5．2 通过调查掌握了PSTVd在中国的发生情况

5．3 了解了PSTVd中国分离物的多态性及遗传进化情况

5．4 PSTVd中国分离物对马铃薯影响显著且不同品种表现不同

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文