苏云金芽胞杆菌增强子结合蛋白的表达纯化及功能研究

摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是蜡样芽胞杆菌族的一个种，与其它芽胞杆菌相比，Bt的显著特点是在形成芽胞的同时，还能产生由杀虫蛋白组成的伴胞晶体。因具有杀虫效果好，对人类和环境友好等优点而成为广泛应用的杀虫微生物。Bt中芽胞的形成与伴胞晶体的产量与菌体不同生长时期的代谢模式之间存在一定的关系。
　　本实验室前期研究发现Bt HD73菌株中sigL基因（编码σ54因子）的缺失降低了芽胞形成率和Cry蛋白的产量，说明σ54调控的代谢途径可能在芽胞形成及晶体合成上具有重要作用。依赖于σ54的转录需要增强子结合蛋白(bacteria Enhancer Binding Proteins，bEBPs)的激活，Bt HD73全基因组中，已发现8种bEBP，本实验室目前已经构建并表达纯化了GabR和SoxR两种蛋白，并验证了它们在HD73中的功能。GabR和SoxR两种蛋白分别调控γ-氨基丁酸(GABA)代谢途径和肌氨酸代谢途径。本研究对其它6种bEBP(AcoR、BkdR、KamR、LevR、PrdR和RocR)进行了克隆表达。构建了这6种bEBP基因带有组氨酸(His)标签的表达载体，并且都能够在大肠杆菌BL21菌株中进行表达。本研究通过镍亲和层析柱纯化得到了BkdR和LevR两种蛋白，为进一步研究EBP的分子调控机制奠定了基础。
　　本研究集中在HD73_1024（编码脯氨酸消旋酶）、HD73_2025（编码支链氨基酸转氨酶）、HD73_4161（编码脯氨酸二肽酶）、HD73_4943（编码乙酸辅酶A连接酶）和HD73_5327（编码依赖于NADPH的脱氢酶），5个基因启动子的转录活性研究，测定了它们在8个EBP缺失突变体中的转录活性。β-半乳糖苷酶活性测定结果表明只有HD73_4161的启动子在gabR突变体中的活性降低，而其它启动子在所有bEBP突变体中的活性与HD73野生菌株相比无明显差异，说明:AcoR、BkdR、GabR、KamR、LevR、PrdR、RcoR和SoxR不是HD73_1024、HD73_2025、HD73_4943和HD73_5327的转录调控因子，GabR可能是HD73_4161的转录调控因子。
　　本研究对AcoR参与的3-羟基丁酮代谢途径的转录调控进行了深入的研究。3-羟基丁酮(acetoin)是许多微生物糖代谢的中间产物，对微生物本身具有重要的生理意义:如抵御环境的酸化、参与NAD+/NADH2比率的调节和作为储存碳源等。在枯草芽胞杆菌、富氧产碱菌（Alcaligenes eutrophus）和肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）等微生物中，3-羟基丁酮是通过氧化裂解降解的，即通过aco基因簇编码的3-羟基丁酮脱氢酶系统降解成乙醛和乙酸。BtHD73菌株的3-羟基丁酮脱氢酶系统也由aco基因簇编码，生物信息学和RT-PCR分析表明Bt HD73的aco基因簇由acoABCL4个基因组成，形成一个转录单元，aco基因簇的启动子含有依赖于σ54转录的-12/-24保守序列。β-半乳糖苷酶活性分析表明，aco基因簇的启动子PacoA转录活性在sigL和acoR突变体中均明显降低。对(⊿)acoR突变体进行表型测定，发现acoR基因的缺失对菌体生长和Cry1Ac蛋白产量无显著影响，但使菌体运动能力减弱，使芽胞产量略有下降，并且不能利用3-羟基丁酮，说明AcoR调控的代谢途径与3-羟基丁酮的利用及菌体的运动能力和芽胞产量相关。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 苏云金芽胞杆菌概述

1．1．1 苏云金芽胞杆菌的生理特征

1．1．2 杀虫基因的命名

1．1．3 苏云金芽胞杆菌cry基因的表达调控

1．2 σ54因子概述

1．2．1 σ54因子的结构特点和作用机制

1．2．2 σ54因子的功能及其调控的代谢途径

1．3 细菌增强子结合蛋白概述

1．3．1 增强子结合蛋白的结构与功能

1．3．2 细菌增强子结合蛋白的研究进展

1．4 细菌中3-羟基丁酮代谢途径

1．4．1 3-羟基丁酮的理化性质

1．4．2 3-羟基丁酮的生理意义

1．4．3 细菌中3-羟基丁酮分解代谢途径

1．5 立题依据和目的意义

1．5．1 立题依据

1．5．2 目的意义

2．材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 抗生素

2．1．4 酶及生化试剂

2．1．5 溶液与缓冲液

2．1．6 引物序列

2．2 仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 模板制备

2．3．2 Bt基因组粗提取

2．3．3 PCR扩增体系

2．3．4 重叠PCR

2．3．5 酶切反应

2．3．6 DNA片段纯化

2．3．7 DNA片段连接反应

2．3．8 大肠杆菌热激感受态细胞的制备及转化

2．3．9 苏云金芽胞杆菌电击感受态细胞的制备与转化

2．3．10 序列测定及分析

2．3．11 突变体生长曲线测定

2．3．12 菌体运动能力测定

2．3．13 芽胞形成率测定

2．3．14 光学显微镜观察

2．3．15 大肠杆菌蛋白表达

2．3．16 大肠杆菌蛋白纯化

2．3．17 蛋白定量及SDS-PAGE电泳

2．3．18 β-半乳糖苷酶活性测定

2．3．19 TRIzol法提取Bt总RNA

2．3．20 RNA的纯化

2．3．21 cDNA合成

2．3．22 RT-PCR

2．3．23 三羟基丁酮含量测定

3 结果与分析

3．1 细菌增强子结合蛋白的表达与纯化

3．1．1 细菌增强子结合蛋白表达载体的构建

3．1．2 细菌增强子结合蛋白的表达与纯化

3．2 受EBP调控的启动子鉴定

3．2．1 P1024启动子转录活性分析

3．2．2 P2025启动子转录活性分析

3．2．3 P4161启动子转录活性分析

3．2．4 P4943启动子转录活性分析

3．2．5 P5327启动子转录活性分析

3．3 3-羟基丁酮代谢途径转录调控研究

3．3．1 aco基因簇的序列分析和RT-PCR分析

3．3．2 aco基因簇转录调控分析

3．3．3 acoR突变体的表型分析

4 讨论

4．1 bEBP蛋白的表达

4．2 σ54调控的3-羟基丁酮代谢

4．3 acoR基因的缺失对Bt的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文